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前 言

 

中國藥典2015年版四部9101《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中對專屬性概念的規(guī)定為：“專屬性系指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力。”由于被測物千差萬別，方法驗(yàn)證時(shí)的專屬性要求各有不同，專屬性驗(yàn)證的異常情況也是五花八門，因此下文中分類說明各種不同類型的驗(yàn)證專屬性異常情況。

 

有關(guān)物質(zhì)

 

有關(guān)物質(zhì)對于專屬性要求主要主要體現(xiàn)在三個(gè)方面：

 

● 已檢出與需要檢出的各組分峰之間的分離度應(yīng)符合要求；

 

● 主峰應(yīng)不包含其他組分，即主峰應(yīng)是單一主成分的峰；

 

● 如果需要進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)評估降解雜質(zhì)的檢出情況，降解產(chǎn)物的分離度應(yīng)符合要求，所有降解產(chǎn)物應(yīng)能被準(zhǔn)確檢出。上述三個(gè)要求在驗(yàn)證中的數(shù)據(jù)體現(xiàn)為分離度、主峰峰純度與降解試驗(yàn)的質(zhì)量平衡結(jié)果。

 

由上文可知，有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證過程中專屬性驗(yàn)證可能出現(xiàn)的異常情況應(yīng)該表現(xiàn)在分離度、主峰峰純度與質(zhì)量平衡驗(yàn)算三個(gè)方面；

 

（1）分離度不符合要求

 

如果分離度不符合要求為正常情況，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行方法的優(yōu)化。本文僅論述方法驗(yàn)證期間分離度不符合要求的異常情況，導(dǎo)致分離度不符合要求的來源主要有色譜柱、儀器、污染等。

 

即使品牌、型號、規(guī)格批號均相同的色譜柱，由于壽命、經(jīng)歷等的差異，其選擇性也可能存在差異，這種差異可能導(dǎo)致方法驗(yàn)證期間選用的色譜柱產(chǎn)生的分離度數(shù)據(jù)異常。為避免該情況的發(fā)生，一般來說方法開發(fā)期間應(yīng)當(dāng)選擇較新的色譜柱，用于方法驗(yàn)證的色譜柱應(yīng)當(dāng)具有較為簡單的“人生經(jīng)歷”，如未使用過含有表面活性劑的流動相、未分析過組分非常復(fù)雜的樣品等，最好為專用柱，并在驗(yàn)證之前預(yù)先評估色譜柱的性能。

 

不同儀器可能得出不同的組分分離結(jié)果，尤其是常見的高壓二元梯度與低壓四元梯度之間，二者經(jīng)常出現(xiàn)分離度有明顯差異的情況。為避免流動相混合機(jī)制的不同導(dǎo)致的分離情況的差異，應(yīng)當(dāng)在方法開發(fā)期間進(jìn)行相應(yīng)的對比研究。如在方法驗(yàn)證期間發(fā)現(xiàn)該情況，應(yīng)使用與方法開發(fā)期間同樣的HPLC進(jìn)行方法驗(yàn)證。

 

污染導(dǎo)致的分離度不符合要求，也非技術(shù)原因，本文不做論述。

 

（2）主峰峰純度不符合要求

 

導(dǎo)致主峰峰純度不符合要求的情況主要來源以下幾個(gè)方面：主成分響應(yīng)過載、較強(qiáng)的流動相本底吸收、不適宜的參數(shù)設(shè)置與噪音。

 

較為常見導(dǎo)致主峰峰純度超過規(guī)定的原因一般為主成分響應(yīng)過載，尤其是自身對照法計(jì)算雜質(zhì)含量的情況，供試品溶液濃度高，主峰響應(yīng)非常強(qiáng)，甚至是峰頂表現(xiàn)出平頭峰的形式。在這種情況下峰純度數(shù)據(jù)一般都不會符合規(guī)定，可以通過降低進(jìn)樣量或供試品溶液濃度的方式進(jìn)行峰純度驗(yàn)證（不改變方法規(guī)定的參數(shù)）。為避免這種情況的發(fā)生，應(yīng)當(dāng)在進(jìn)行峰純度驗(yàn)證的同時(shí)，對主成分峰在規(guī)定的波長范圍內(nèi)的響應(yīng)情況進(jìn)行評估，均不得有過載的現(xiàn)象。

 

較強(qiáng)的流動相本底吸收，會導(dǎo)致低波長下的響應(yīng)數(shù)據(jù)不符合主成分真實(shí)值，造成峰純度不符合要求，一般情況下，在方法開發(fā)期間應(yīng)當(dāng)對此進(jìn)行評估與優(yōu)化，避免流動相對檢測的干擾。在方法驗(yàn)證時(shí)發(fā)生存在該情況，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化峰純度的參數(shù)，如將波長范圍的最小波長適當(dāng)增大。

 

如果不適宜的積分參數(shù)產(chǎn)生不適宜的峰起止時(shí)間，也可能造成峰純度不符合要求，可通過優(yōu)化積分參數(shù)的方式解決該問題。

 

噪音水平也會對峰純度的計(jì)算產(chǎn)生影響，方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)當(dāng)評估噪音水平，必要時(shí)更換噪音水平較好的儀器，或進(jìn)行其他優(yōu)化如使用鬼峰捕集柱等。

 

（3）降解試驗(yàn)的質(zhì)量平衡驗(yàn)算不符合要求

 

如果專屬性驗(yàn)證進(jìn)行了降解試驗(yàn)的研究，應(yīng)當(dāng)評估主成分的減少量與雜質(zhì)的增加量二者之間的平衡，以確認(rèn)所有可能的降解雜質(zhì)均能被準(zhǔn)確檢出。導(dǎo)致質(zhì)量平衡驗(yàn)算不符合要求的原因主要有以下三個(gè)：特定降解雜質(zhì)未被檢出、二次降解、降解雜質(zhì)含量不能準(zhǔn)確計(jì)算與不適宜的降解量。

 

如果因特定降解雜質(zhì)未被檢出，導(dǎo)致質(zhì)量平衡驗(yàn)算不符合要求，應(yīng)當(dāng)對該特定雜質(zhì)進(jìn)行評估，如該雜質(zhì)在樣品生產(chǎn)與貯存過程不可能產(chǎn)生，則可進(jìn)行相應(yīng)的說明，并優(yōu)化降解條件避免該雜質(zhì)產(chǎn)生；如該雜質(zhì)在樣品生產(chǎn)與貯存過程可能存在，則應(yīng)當(dāng)對檢測方法進(jìn)行優(yōu)化。

 

降解試驗(yàn)條件不宜過于劇烈，導(dǎo)致降解雜質(zhì)的二次降解，增加了質(zhì)量平衡驗(yàn)算不符合要求的風(fēng)險(xiǎn)。二次降解產(chǎn)物一般在樣品生產(chǎn)與貯存過程不可能產(chǎn)生。為避免該情況的發(fā)生，應(yīng)當(dāng)在對樣品的化學(xué)性質(zhì)有了充分了解的前提下，進(jìn)行預(yù)先的降解試驗(yàn)研究，確定驗(yàn)證時(shí)的降解試驗(yàn)條件。

 

如果主要降解雜質(zhì)為未知雜質(zhì)，其真實(shí)響應(yīng)與主成分存在較大差異，那么就會導(dǎo)致計(jì)算出的該雜質(zhì)含量與真實(shí)值相差較大，導(dǎo)致質(zhì)量平衡驗(yàn)算不符合要求。為避免這種情況，應(yīng)當(dāng)在更早的時(shí)期對降解雜質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的研究，獲得降解雜質(zhì)的對照品。

 

質(zhì)量平衡驗(yàn)算的方法可以為主成分含量的減少值與雜質(zhì)的增加值的比值，應(yīng)在90%-110%的范圍內(nèi)，主成分含量的減少值一般應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的含量測定方法進(jìn)行確定，建議主成分的減少量在10%-20%之間；不宜過少使計(jì)算結(jié)果誤差較大，也不宜過大增加二次降解的風(fēng)險(xiǎn)。

 

殘留溶劑

 

殘留溶劑的研究在某種意義上與有關(guān)物質(zhì)類似，是對供試品中可能存在的溶劑進(jìn)行系統(tǒng)的研究，包括已知的溶劑與未知的溶劑。在目前的專屬性驗(yàn)證中，大多只是研究色譜圖中已知溶劑峰之間的分離情況，忽略了未知溶劑的研究。由于現(xiàn)在采用的氣相色譜柱大多為毛細(xì)管柱，具有非常高的柱效，一般情況下方法驗(yàn)證時(shí)溶劑峰之間的分離度不符合要求的情況較少（方法開發(fā)如何優(yōu)化分離度不在本文論述范圍），因此本文著重論述殘留溶劑方法驗(yàn)證時(shí)出現(xiàn)的未知溶劑峰。

 

未知溶劑峰的來源一般主要從兩個(gè)方面：樣品本身與污染。

 

（1）樣品本身引入的未知溶劑峰

 

樣品本身引入的未知溶劑峰在方法驗(yàn)證期間需要進(jìn)行細(xì)致的研究，說明其來源，必要時(shí)確認(rèn)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，制定合理的限度；如不對該溶劑進(jìn)行檢測，應(yīng)當(dāng)具有合理的理由。

 

樣品本身引入的溶劑峰來源一般有以下幾個(gè)來源：副反應(yīng)產(chǎn)物、降解產(chǎn)物與熱降解產(chǎn)物。

 

API在合成過程中可能產(chǎn)生一些副反應(yīng)產(chǎn)物為有機(jī)溶劑殘留在供試品中，如酰氯遇醇的酯化物或某些基團(tuán)脫落的小分子產(chǎn)物等，為避免方法驗(yàn)證時(shí)該類溶劑的干擾，應(yīng)當(dāng)在方法開發(fā)期間對這種可能的副反應(yīng)產(chǎn)物溶劑進(jìn)行系統(tǒng)的評估。方法驗(yàn)證期間，可通過GCMS確認(rèn)其結(jié)構(gòu)式，如為預(yù)期的副反應(yīng)產(chǎn)物，且含量較高，應(yīng)當(dāng)訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，制定合理的限度。

 

某些降解產(chǎn)物可能為有機(jī)溶劑，應(yīng)當(dāng)訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，制定合理的限度。

 

如果供試品遇熱不穩(wěn)定，進(jìn)行殘留溶劑檢測時(shí)的未知溶劑峰為熱降解產(chǎn)物，則可通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)與理論說明該未知溶劑峰為熱降解產(chǎn)物，無需訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。必要時(shí)優(yōu)化檢測條件，避免熱降解產(chǎn)物的產(chǎn)生。

 

（2）污染

 

污染產(chǎn)生的未知溶劑主要有兩大來源生產(chǎn)過程與檢測過程。生產(chǎn)過程可能引入未知溶劑常見于不同產(chǎn)品在同一干燥設(shè)備中干燥的交叉污染，檢測過程引入的未知溶劑常見于供試品溶液與其他有機(jī)溶劑位置較近通過空氣傳播導(dǎo)致的污染等。由于這些情況并非技術(shù)原因，且有無數(shù)種可能性，通過相關(guān)管理制度可避免，本文不再詳細(xì)論述。