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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-02-07 15:46
膠囊劑是指藥物或加有輔料充填于空心膠囊或密封于軟質(zhì)囊材中的固體制劑。根據(jù)膠囊的溶解與釋放特性可分為硬膠囊、軟膠囊、調(diào)釋膠囊等。根據(jù)囊材的不同，又可分為明膠膠囊和非明膠膠囊（如HPMC膠囊）。其內(nèi)容物包括非水溶液、混懸液、半固體、固體粉末、微丸、顆粒等。明膠空心膠囊是由膠囊用明膠加輔料制成的空心硬膠囊，在膠囊劑中應(yīng)用最多。
明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象指明膠囊殼在貯存過程中發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使制劑在不加酶的溶出介質(zhì)中的崩解、溶出、釋放效率降低的現(xiàn)象。在藥物的穩(wěn)定性考察試驗(yàn)中，膠囊交聯(lián)現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)，表現(xiàn)為在進(jìn)行溶出試驗(yàn)時(shí)膠囊變成了一個(gè)類似橡膠質(zhì)樣的脹大的水不溶膜，此水不溶膜在溶出試驗(yàn)中能夠使膠囊的崩解時(shí)間延長(zhǎng)、藥物溶出速率下降、甚至造成藥物完全不能溶出。
籃法中的膠囊交聯(lián)現(xiàn)象
槳法中的膠囊交聯(lián)現(xiàn)象
遇到明膠膠囊交聯(lián)問題如何思考與應(yīng)對(duì)？本文淺談一下研究思路，僅供藥物研發(fā)同仁參考。
一、交聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理及防止措施
明膠是一系列水溶性膠原蛋白衍生物的混合物，它是一種線性高分子聚合物，分子量15000至25000，由酰胺鍵連接各種氨基酸構(gòu)成，組成的氨基酸包括:甘氨酸25.5%；脯氨酸18.0%；羥脯氨酸14.1%；谷氨酸11.4%；丙氨酸8.5%；精氨酸8.5%；天門冬氨酸6.6%；賴氨酸4.1%；亮氨酸3.2%；纈氨酸2.5%；苯丙氨酸2.2%；蘇氨酸1.9%；異亮氨酸1.4%；蛋氨酸1.0%；組氨酸0.8%；酪氨酸0.5%；絲氨酸0.4%；胱氨酸0.1%；半胱氨酸0.1%。
交聯(lián)反應(yīng)的形成主要?dú)w因于有三個(gè)官能團(tuán)的氨基酸，尤其是賴氨酸。一些報(bào)道提出組氨酸和精氨酸也參與交聯(lián)反應(yīng)的形成。
1、交聯(lián)反應(yīng)的主要機(jī)理
明膠中賴氨酸游離氨基酸殘基間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。
賴氨酸殘基的氧化去氨基化，得到一個(gè)末端的醛官能團(tuán)，這個(gè)醛與相鄰賴氨酸的ε-氨基結(jié)合得到一個(gè)亞胺，然后經(jīng)過一系列aldol（羥醛反應(yīng)）類縮合反應(yīng)得到含有吡啶環(huán)的交聯(lián)產(chǎn)物。
賴氨酸與外源的醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。
賴氨酸ε-氨基與外源的醛，比如處方中的雜質(zhì)或處方與外界環(huán)境接觸后生成的醛發(fā)生反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)生成一個(gè)羥甲基氨基衍生物，脫水后生成含有一個(gè)陽(yáng)離子的亞胺，后者與另一分子的羥甲基氨基賴氨酸殘基生成二亞甲基醚，最后重排生成一個(gè)連接兩個(gè)賴氨酸ε-氨基的亞甲基，從而形成交聯(lián)。
形成胺縮醛后發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。
胺縮醛，即乙縮醛的氨基形式。胺縮醛是通過陽(yáng)離子亞胺中間體（同上述陽(yáng)離子亞胺的形成過程）與一個(gè)游離氨基反應(yīng)生成。這一反應(yīng)對(duì)周圍的pH很敏感。人體胃液的環(huán)境與體外溶出環(huán)境不同，胃液中含有酶，膠囊交聯(lián)引起的溶出延遲或不溶出對(duì)于體內(nèi)溶出究竟有沒有意義目前還很難下結(jié)論。在膠囊劑產(chǎn)品的開發(fā)階段，能夠可能導(dǎo)致交聯(lián)問題的每一個(gè)因素都應(yīng)仔細(xì)考慮，從早期設(shè)計(jì)階段就要盡可能避免，或者通過高溫、高濕試驗(yàn)來進(jìn)行預(yù)判，盡早采取措施進(jìn)行防止或制定相應(yīng)研究對(duì)策。
2、防止交聯(lián)反應(yīng)的方法
選擇不易產(chǎn)生醛類物質(zhì)或不易促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的輔料。
在制劑的輔料中，增塑劑、防腐劑、脂肪、聚乙烯化合物比如：PEG、脂肪族醇類、脂肪族酚類、聚乙烯甘油酯等均易產(chǎn)生醛類物質(zhì)。非離子表面活性劑吐溫80，由于分子中含有聚氧乙烯基，易發(fā)生氧化降解，形成甲醛。
對(duì)于易產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)的藥物，不宜開發(fā)成硬膠囊、軟膠囊等劑型。
如吉非貝齊、依托度酸、氯霉素、呋喃妥因、撲熱息痛、地高辛、維生素、布洛芬等在放樣過程中均出現(xiàn)溶出度顯著下降的情況。含有醛基的藥物與明膠殘基發(fā)生反應(yīng)，使明膠發(fā)生交聯(lián)。
控制外界環(huán)境中溫度、濕度、光照等因素的影響。
交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生受外界環(huán)境中溫度、濕度、光線的影響。膠囊應(yīng)貯存在溫度15~25℃，相對(duì)濕度30%~40%，陰涼干燥避光處貯存。室溫下交聯(lián)反應(yīng)較不易發(fā)生，長(zhǎng)期儲(chǔ)存于高溫下的明膠分子中氨基酸殘基易發(fā)生自氧化而形成醛基,形成的醛基可以和周圍明膠分子上的氨基酸殘基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),使明膠分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化后,水溶性大幅下降。并且隨著溫度的升高，交聯(lián)反應(yīng)的程度越劇烈。高濕條件的影響尤為重大，它可以催化亞胺中間體的形成，催化輔料降解成促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的降解產(chǎn)物，同時(shí)使氧氣更容易穿透明膠分子，從而加速對(duì)它的氧化作用。紫外可見光與高溫、高濕相互作用也促進(jìn)了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生和促進(jìn)明膠的自氧化有關(guān)。
囊殼處方因素的影響
囊殼處方是決定囊殼交聯(lián)的主要因素：(1)明膠的選擇：明膠的交聯(lián)程度主要是受明膠中氨基酸的殘基量影響，明膠中賴氨酸和精氨酸的含量越低，則交聯(lián)發(fā)生程度和可能性越低。(2)囊殼的含水量：囊殼中含水量高時(shí)，可以加快明膠的氧化，使亞胺中間體的產(chǎn)生加快。(3)增塑劑：甘油和山梨醇等增塑劑會(huì)使明膠的自氧化作用增強(qiáng)。(4)遮光劑和著色劑：加入的遮光劑和著色劑可能誘導(dǎo)醛類分子產(chǎn)生，從而與明膠發(fā)生胺縮醛反應(yīng)。(5)鐵離子：膠囊中含有鐵離子，使氨基酸經(jīng)芬頓化學(xué)反應(yīng)，生成羥基自由基(·OH)，羥基自由基氧化氨基酸的氨基和中心碳原子，導(dǎo)致明膠交聯(lián)，但鐵離子含量對(duì)交聯(lián)現(xiàn)象的影響不能確定。(6)鐵離子和鋁離子：Fe3+除催化羥基自由基生成外，F(xiàn)e3+和Al3+能與明膠游離的羥基形成配合物。
二、明膠膠囊交聯(lián)研究的指導(dǎo)原則USP<711>
USP<711> Dissolution溶出度項(xiàng)下規(guī)定，如果是因?yàn)榻宦?lián)引起了溶出度不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，應(yīng)進(jìn)行二級(jí)溶出試驗(yàn)（Tier II），即添加酶和不添加酶溶出試驗(yàn)。對(duì)于不同pH的溶出介質(zhì)，選用的酶的種類也不一樣，以下為各個(gè)pH條件下推薦的酶種類、濃度、活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)/方法（很有用哦?。?/span>
Dissolution Medium with pH 4.0
Enzyme: Pepsin（胃蛋白酶）, activity determined by the procedure in purified pepsin, in the Reagent Specifications section
Amount: A quantity of pepsin that results in an activity of NMT 750,000 Units/L of dissolution medium
Dissolution Medium with pH >4.0 and <6.8
Enzyme: Papain（木瓜蛋白酶）, activity determined by the Assay test in the monograph for Papain; or bromelain（菠蘿蛋白酶）, activity determined by the procedure in bromelain, in the Reagent Specifications section
Amount: A quantity of papain that results in an activity of NMT 550,000 Units/L of dissolution medium, or a quantity of bromelain that results in an activity of NMT 30 gelatin-digesting units (GDU)/L of dissolution medium
Dissolution Medium with pH 6.8
Enzyme: Pancreatin（胰酶）, protease activity determined by the procedure in Assay for protease activity (Casein digestive power) in the monograph for Pancreatin
Amount: A quantity of pancreatin that results in a protease activity of NMT 2000 Units/L of dissolution medium
溶出介質(zhì)中含有表面活性劑或其他能影響酶活性的其他成分時(shí)，USP也有重要說明，作者將原文及主要翻譯列舉如下：
If the dissolution medium contains surfactant or other ingredients that are known to denature the enzyme used, a pretreatment step in the dissolution testing of the dosage form may be applied（加入預(yù)處理步驟）.This pretreatment step is done using the specified dissolution medium without the surfactant or the ingredient and with the addition of the appropriate amount of enzyme according to the medium pH（預(yù)處理步驟中不含破壞成分只含有適當(dāng)?shù)拿福? The amount of enzyme added is appropriate to the volume of dissolution medium used in the pretreatment（酶的量應(yīng)該適當(dāng)）.To achieve the specified medium volume for the final dissolution testing, the pretreatment step may be conducted with a smaller volume of medium without the ingredient such that the final volume is obtained when the ingredient is added at the end of the pretreatment step（預(yù)處理步驟中應(yīng)采用一個(gè)小的介質(zhì)體積，預(yù)處理步驟結(jié)束后加至最終體積）. All of the other conditions of the test (apparatus, rotation, orflow rate) should remain as described in the method or monograph（溶出條件與標(biāo)準(zhǔn)方法相同）. Typically, the duration of the pretreatment step is NMT 15 min（通常，預(yù)處理步驟不超過15min）. The required pretreatment time should be evaluated on a case-by-case basis and should be scientifically justified（所需的預(yù)處理時(shí)間具體問題具體分析，應(yīng)進(jìn)行科學(xué)說明）. This time should be included in the total time of the test（預(yù)處理時(shí)間包括在總測(cè)定時(shí)間中）. As an example, if the total time of the test is 45 min and 15 minare used in the pretreatment step, the test will continue for 30 min after the addition of the ingredient（例如，總?cè)艹鰰r(shí)間為45min，預(yù)處理為15min，加入其它成分后繼續(xù)進(jìn)行30min）。
了解影響酶活性的表面活性劑種類很重要。Guzman等就胃蛋白酶分別在含十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和吐溫-80四種表面活性劑的溶出介質(zhì)中的活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，添加SDS會(huì)降低胃蛋白酶的活性，即使低濃度SDS仍會(huì)明顯降低其活性。而添加任意濃度的CTAB、Triton X-100 和吐溫-80均不會(huì)影響胃蛋白酶的活性。Guncheva等對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行相似研究，結(jié)果為非離子型表面活性劑(吐溫-80和Triton X-100)能夠增強(qiáng)胰蛋白酶的活性，而離子型表面活性劑(SDS和CTAB)會(huì)抑制其活性，因此在添加胰蛋白酶的體外溶出試驗(yàn)中建議使用非離子型表面活性劑。關(guān)于表面活性劑對(duì)溶出介質(zhì)中木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶活性的影響研究尚未見報(bào)道。
三、問題分析與討論
1、如何理解FDA溶出數(shù)據(jù)庫(kù)中的Tier I和Tier II？
以Ziprasidone HCl膠囊為例，F(xiàn)DA溶出數(shù)據(jù)庫(kù)中規(guī)定了Tier I和Tier II方法，見下表。根據(jù)USP711，如果膠囊有交聯(lián)現(xiàn)象，可以在介質(zhì)中加入酶。如果溶出介質(zhì)中含有表面活性劑，酶活性會(huì)受到破壞，因此需要采用無酶介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，最長(zhǎng)時(shí)間不得超過15min，然后再加入含酶介質(zhì)。本例中的意思是，該膠囊采用Tier I進(jìn)行溶出測(cè)試，當(dāng)發(fā)生交聯(lián)的時(shí)候可采用Tier II。如果采用Tier I方法時(shí)發(fā)現(xiàn)S1階段不合格，采用Tier II并應(yīng)符合S1階段要求，不必再繼續(xù)采用Tier I方法繼續(xù)考察S2、S3。
2、選擇加入酶之前需要考慮哪些問題？
首先，應(yīng)確定溶出變慢確實(shí)是由膠囊交聯(lián)引起的，這一點(diǎn)很重要。方法有目測(cè)法（觀察到膠囊吸水膨脹，沒有破裂或者部分破裂）、轉(zhuǎn)換法（把膠囊的內(nèi)容物撞到新的沒有發(fā)生交聯(lián)的囊殼里）。其次，需要根據(jù)介質(zhì)的pH，參考USP711選擇加入酶的種類與來源（必要時(shí)根據(jù)研究情況固定廠家）。第三，需要酶種類規(guī)定測(cè)定酶活性，并確定下來酶的測(cè)定方法，因?yàn)槊傅臏y(cè)定方法很關(guān)鍵。
3、在穩(wěn)定性考察過程中發(fā)現(xiàn)交聯(lián)怎么辦？
首先，還是必須先評(píng)估并確定溶出變慢或不溶出是由交聯(lián)引起的，而不是由制劑本身性能變化引起的。其次，根據(jù)USP711采用加酶的方法進(jìn)行溶出度測(cè)試。第三，后續(xù)時(shí)間點(diǎn)均需采用加酶的方法進(jìn)行測(cè)試，完成數(shù)據(jù)對(duì)比。
4、在每一個(gè)溶出杯中加酶還是配制含酶的介質(zhì)？
根據(jù)USP711，如果因?yàn)榻宦?lián)引起溶出度試驗(yàn)失敗，首先應(yīng)考慮復(fù)測(cè)，而不是在已發(fā)生交聯(lián)的溶出杯中加入酶。如果在每一個(gè)溶出杯中加入酶需要多次稱量，加入，溶解非常麻煩，因此，建議一次配制含酶介質(zhì)，如6L、8L、10L等。
5、如果在制劑開發(fā)階段就發(fā)現(xiàn)了交聯(lián)現(xiàn)象怎么考慮？
首先，應(yīng)分析可能的原因，如醛、高溫、高濕的影響。處方中成分是否含有少量的醛類或可能產(chǎn)生醛類的物質(zhì)，如是，應(yīng)進(jìn)行輔料的內(nèi)控或者替代研究；膠囊貯藏條件是否正確，如是，應(yīng)選擇恰當(dāng)?shù)陌募百A藏條件。
6、加酶的溶出方法是否需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證？
需要的。例如，（1）應(yīng)檢查并確定介質(zhì)的pH；（2）根據(jù)pH選擇酶的種類；（3）確定酶活性測(cè)定方法；（4）介質(zhì)中酶的量如何計(jì)算；（5）研究并確定溶出度不符合規(guī)定是由膠囊交聯(lián)引起的；（6）加入酶后的濾膜驗(yàn)證試驗(yàn)；（7）加入酶后對(duì)檢測(cè)方法是否產(chǎn)生干擾（專屬性）；（8）如果介質(zhì)中含有SDS等表面活性劑應(yīng)研究預(yù)處理步驟中的時(shí)間、體積；（9）最終制定的加酶不加酶溶出方法。
四、案例分享：開發(fā)Tier II方法的思路
問題描述：某產(chǎn)品，經(jīng)加速3個(gè)月后，采用Tier I 方法測(cè)定，即900 mL的0.01 N HCl+1.0% SDS溶液。發(fā)現(xiàn)溶出曲線中溶出量在10~60min明顯下降，批內(nèi)RSD明顯變大，數(shù)據(jù)如下。由于限度為75%@45min，因此，溶出度已經(jīng)不合格了。如何解決此類問題？
通過現(xiàn)象觀察發(fā)現(xiàn)，可能是由于交聯(lián)引起的，因此設(shè)計(jì)了三種實(shí)驗(yàn)，采用舊內(nèi)容物+新膠囊殼、新內(nèi)容物+舊膠囊殼、新內(nèi)容物+新膠囊殼進(jìn)行溶出曲線對(duì)比。根據(jù)對(duì)比可見，新內(nèi)容物+舊膠囊殼的溶出量很低，變異大，因此與其他兩組相比較可以判斷是由膠囊殼產(chǎn)生交聯(lián)引起的。
根據(jù)本品的介質(zhì)pH，選擇胃蛋白酶直接加入到900ml介質(zhì)中，測(cè)定6粒膠囊的結(jié)果如下所示。結(jié)果表明，SDS引起了酶的降解，這種方法不可行，必須分步驟加入。
為了去除SDS對(duì)破囊試驗(yàn)的影響，介質(zhì)1配制為不含SDS的0.01 N HCL + 750,000 units/L 胃蛋白酶溶液；先加入600 mL介質(zhì)1，2min后發(fā)現(xiàn)6個(gè)膠囊開始散開，5min后加入300ml介質(zhì)2，即0.01 N HCL+3%SDS溶液,最終介質(zhì)組成為0.01 N HCL +1% SDS即500,000 units/L胃蛋白酶。
隨后，整個(gè)Tier II方法進(jìn)行了完整的方法學(xué)驗(yàn)證，包括線性、專屬性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度、對(duì)照品溶液和供試品溶液穩(wěn)定性等。
五、總結(jié)
明膠膠囊交聯(lián)在膠囊劑開發(fā)中，特別是穩(wěn)定性考察中經(jīng)驗(yàn)遇到，采用合理的研究思路至關(guān)重要，中國(guó)藥典溶出度通則中沒有規(guī)定如何進(jìn)行研究。作者建議，在注冊(cè)申報(bào)階段應(yīng)考慮進(jìn)行必要的說明，以免被發(fā)補(bǔ)。
六、參考文獻(xiàn)
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來源：Internet
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