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嘉峪檢測網(wǎng) 2022-02-08 22:32
你知道如何做方法開發(fā)？一般包括幾個步驟嗎？今天就分享給大家一篇氣相色譜方法開發(fā)詳細步驟的干貨內(nèi)容，希望能對你的工作有所幫助。
作者曾經(jīng)接觸過不少剛從事GC工作的技術人員，他們能很快掌握必要的GC基礎知識，甚至能很快操作儀器。但當接到一個分析任務時，面對樣品不敢確定從何做起。也有一些人認為GC分析很簡單，不就是打一針就可得到結(jié)果嗎。其實不然！就如醫(yī)院的護士打針，你若不了解病人情況，不知道用藥的劑量，隨便給病人打一針就能治病嗎？
這就涉及到了方法開發(fā)問題。簡單地說，方法開發(fā)就是針對一個或一批樣品建立一套完整的分析方法。就GC而言，就是首先確定樣品預處理方法，然后優(yōu)化分離條件，直至達到滿意的分離結(jié)果。最后建立數(shù)據(jù)處理方法，包括定性鑒定和定量測定。當然，這一方法要真正成為實用方法，還必須進行驗證。下面首先討論方法開發(fā)的一般步驟。
步驟一：樣品來源及其預處理方法
GC能直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當?shù)娜軇┲校疫€要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽）或可能會損壞色譜柱的組分。這樣，我們在接到一個未知樣品時，就必須了解它的來源，從而估計樣品可能含有的組分，以及樣品的沸點范圍。如能確認樣品可直接分析，問題就簡單了。只要找一種合適的溶劑，如丙酮、己烷、氯仿、苯等就是GC常用的溶劑。一般講，溶劑應具有較低的沸點，從而使其容易與樣品分離。盡可能避免用水、二氯甲烷和甲醇作溶劑，因為它們對延長色譜柱的使用壽命不利。另外，如果用毛細管柱分析，應注意樣品的濃度不要太高，以免造成柱超載，通常樣品的濃度為mg/ml級或更低。
如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或者樣品濃度太低，就必須進行必要的預處理，包括采用一些預分離手段，如各種萃取技術、濃縮方法、提純方法等。下面給出一個簡要的樣品預處理指南（見表5-1-4），表5-1-4 樣品處理指南有關各種處理方法的詳細信息，請讀者參看《色譜分析樣品處理》分冊。
需要強調(diào)的一點是，無論樣品處理方法，還是下面要討論的GC分析條件確定，文獻調(diào)研都是很重要的方法開發(fā)步驟。所以，開始實驗前，應當查一下文獻。若文獻中已有相同樣品的分析方法，那就會大大加快方法開發(fā)的過程。只要在此基礎上作一些必要的優(yōu)化即可。即使能找到類似樣品的分析方法，也可以作為重要的參考，從而避免走一些不必要的彎路。
步驟二：確定儀器配置
所謂儀器配置就是用于分析樣品的方法采用什么進樣裝置、什么載氣、什么色譜柱以及什么檢測器。比如，要用GC分析啤酒的揮發(fā)性成分，就需要一個頂空進樣器；要測定水中痕量含氯農(nóng)藥的殘留量，就要用電子俘獲檢測器。就色譜柱而言，常用的固定相有非極性的OV-1（SE-30）、弱極性的SE-54、極性的OV-17和PEG-20M等。可根據(jù)極性相似相容原理來選用，即分離一般脂肪烴類（如柴油或汽油）時多用OV-1（SE-30），分析醇類和酯類（如含酒精飲料）多用PEG-20M，分析農(nóng)藥殘留量則多用OV-17或OV-1701。而要分析特殊的樣品，如手性異構體，就需要特殊的色譜柱。對于很復雜的混合物，SE-54往往是首選的固定相。
步驟三：確定初始操作條件
當樣品準備好，且儀器配置確定之后，就可開始進行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進樣量、進樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。
進樣量要根據(jù)樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。樣品濃度不超過12 3 14 時填充柱的進樣量通常為1-5μL，而對于毛細管柱，若分流比為50:1時，進樣量一般不超過2μL。如果這樣的進樣量不能滿足檢測靈敏度的要求，可考慮加大進樣量，但以不超載為限。必要時先對樣品進行預濃縮，還可考慮采用專門的進樣技術，如大體積進樣，還可采用靈敏度更高的檢測器。
進樣口溫度主要由樣品的沸點范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度。即首先要保證待測樣品全部汽化，其次要保證汽化的樣品組分能夠全部流出色譜柱，而不會在柱中冷凝。原則上講，進樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點最高的組分的沸點，但要低于易分解組分的分解溫度，常用的條件是250-350℃。大多數(shù)先進GC儀器的進樣口溫度均可達到450℃。這時，沸點為+**7左右的組分均可汽化（因為在溶液狀態(tài)下，組分的沸點會降低一些）。實際操作中，進樣口溫度可在一定范圍內(nèi)設定，只要保證樣品完全汽化即可，而不必進行很精確的優(yōu)化。注意，當樣品中某些組分會在高溫下分解時，就用適當降低汽化溫度。必要時可采用冷柱上進樣或程序升溫汽化（PTV）進樣技術。
色譜柱溫度的確定主要由樣品的復雜程度和汽化溫度決定。原則是既要保證待測物的完全分離，又要保證所有組分能流出色譜柱，且分析時間越短越好。組成簡單的樣品最好用恒溫分析，這樣分析周期會短一些。特別是用填充柱時，恒溫分析時色譜圖的基線要比程序升溫時穩(wěn)定得多。對于組成復雜的樣品，常需要用程序升溫分離，因為在恒溫條件下，如果柱溫較低，則低沸點組分分離得好，而高沸點組分的流出時間會太長，造成峰展寬，甚至滯留在色譜柱中造成柱污染；反之，當柱溫太高時，低沸點組分又難以分離。圖5-1-3給出了一個示意圖。說明程序升溫的必要性。實際上，毛細管柱的一個最大優(yōu)點就是可在較寬的溫度范圍內(nèi)操作這樣既保證了待測組分的良好分離，又能實現(xiàn)盡可能短的分析時間。
一般來講，色譜柱的初始溫度應接近樣品中最輕組分的沸點，而最終溫度則取決于最重組分的沸點。升溫速率則要依樣品的復雜程度而定。在沒有資料可供參考的情況下，建議毛細管柱的嘗試溫度條件設置為：
注意，這只是方法開發(fā)時的初始參考條件，具體工作中一定要根據(jù)樣品的實際分離情況來優(yōu)化設定。
檢測器的溫度是指檢測器加熱塊溫度，而不是實際檢測點，如火焰的溫度。檢測器溫度的設置原則是保證流出色譜柱的組分不會冷凝，同時滿足檢測器靈敏度的要求。大部分檢測器的靈敏度受溫度影響不大，故檢測器溫度可參照色譜柱的最高溫度設定，而不必精確優(yōu)化。比如在使用OV-101或OV-1毛細管色譜柱時，火焰離子化檢測器（FID）的溫度可設定為300℃。
載氣流速的確定相對容易一些，開始可按照比最佳流速（氮氣約為20cm/s，氦氣約為25cm/s，氫氣約為30cm/s）高10%來設定。然后再根據(jù)分離情況進行調(diào)節(jié)。原則是既保證待測物的完全分離，又要保證盡可能短的分析時間。用填充柱時，載氣流速一般設為30ml/min。
需要指出的是，當儀器沒有配置電子氣路控制（EPC）時，必須通過皂膜流量計或測定死時間的方法來測定載氣流速，通過調(diào)節(jié)往前壓的方式來改變載氣流速。色譜柱越長，內(nèi)徑越小，柱溫越高，需要柱前壓越高。表5-1-5給出了常用毛細管色譜柱采用的柱前壓參考數(shù)值范圍。初始條件一般設置為表中給定范圍的上限，然后根據(jù)實際分離情況再進行優(yōu)化。
表5-1-5 毛細管GC常用的柱前壓參考值
此外，當所用檢測器需要燃燒氣和/或輔助氣時，還要設定這些氣體的流量。有關檢測器的說明書通常會列出適合的氣體流量值，可供參考。比如，用毛細管柱和FID時，檢測器氣體流量可設定為：
上述初始條件設定后，便可進行樣品的嘗試性分析。一般先分離標準樣品，然后分析實際樣品。在此過程中，還要根據(jù)分離情況不斷進行條件優(yōu)化。
步驟四：分離條件優(yōu)化
分離優(yōu)化是一個很大的題目，有專門的優(yōu)化理論來研究，市場上還有計算機軟件可用于優(yōu)化。本書不準備就此展開詳細討論，只是在下一節(jié)從實用的角度簡單介紹優(yōu)化方法。在這里只強調(diào)操作條件柱溫和載氣流速的優(yōu)化。
事實上，當樣品和儀器配置確定之后，一個色譜技術人員最經(jīng)常的工作除了更換色譜柱外，就是改變色譜柱溫和載氣流速，以期達到最優(yōu)化的分離。柱溫對分離結(jié)果的影響要比載氣的影響大。
簡單地說，分離條件的優(yōu)化目的就是要在最短的分析時間內(nèi)達到符合要求的分離結(jié)果。所以，當在初始條件下樣品中難分離物質(zhì)對的分離度R大于1.5時，可采用增大載氣流速、提高柱溫或升溫速率的措施來縮短分析時間，反之亦然。比較難的問題是確定色譜圖上的峰是否單一組分的峰。這可用標準樣品對照，也可用GC/MS測定峰純度。如果某一感興趣的峰是兩個以上組分的共流出峰，優(yōu)化分離的任務就比較艱巨了。在改變柱溫和載氣流速也達不到基線分離的目的時，就應更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因為在GC中，色譜柱是分離成敗的關鍵。
步驟五：定性鑒定
所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對于簡單的樣品，可通過標準物質(zhì)對照來定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標準樣品和實際樣品，根據(jù)保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對未知樣品的定性僅僅用一個保留數(shù)據(jù)是不夠的。雙柱或多柱保留指數(shù)定性是GC中較為可靠的方法，因為不同的化合物在不同色譜柱上具有相同保留值的幾率要小得多。對于復雜的樣品，則要通過保留指數(shù)和/或GC/MS來定性。事實上，GC/MS是當今GC定性的首選方法，它可以給出相應色譜峰的分子結(jié)構信息，同時還能做定量分析。不過，我們應當了解，GC/MS并不總是可靠的，尤其是一些同分異構體，它們的質(zhì)譜圖往往非常相似，故計算機檢索結(jié)果有時是不正確的。只有當GC保留指數(shù)和MS圖的鑒定結(jié)果相吻合時，定性的可靠性才是有保障的。
步驟六：定量分析
在這一步驟是要確定用什么定量方法來測定待測組分的含量。常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內(nèi)標法、外標法和標準加入法（又叫疊加法）。表5-1-6列出了這些方法的原理和特點。
表5-1-6 色譜定量方法比較
峰面積（峰高）百分比法最簡單，但最不準確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時，該法才是可選擇的。當然，在有機合成過程中監(jiān)測反應原料和+ 或產(chǎn)物的變化時，也可用此法作相對定量。
因為不同的化合物在同一條件下、同一檢測器上的響應因子（單位峰面積代表的樣品量）往往不同，故須用標準樣品測定響應因子進行校正后，方可得到準確的定量結(jié)果。其他幾種定量方法均需要校正。相比起來，歸一化法較為復雜，它要求樣品中所有的組分均出峰，且要求有所有組分的標準品才能定量，故很少采用。外標法是采用最頻繁的方法，只要用一系列濃度的標準樣品作出工作曲線（樣品量或濃度對峰面積或峰高作圖），就可在完全一致的條件下對未知樣品進行定量分析。只要待測組分出峰且分離完全即可，而不考慮其他組分是否出峰和是否分離完全。需要強調(diào)，外標法定量時，分析條件必須嚴格重現(xiàn)，特別是進樣量。如果測定未知物和測定工作曲線時的條件有所不同，就會導致較大的定量誤差。還應注意，外標工作曲線最好與未知樣品同時測定，或者定期重新測定工作曲線，以保證定量準確度。
相比而言，內(nèi)標法的定量精度最高，因為它是用相對于標準物（叫內(nèi)標物）的響應值來定量的，而內(nèi)標物要分別加到標準樣品和未知樣品中。這樣就可抵消由于操作條件（包括進樣量）的波動帶來的誤差。與外標法類似，內(nèi)標法只要求待測組分出峰且分離完全即認可，其余組分則可用快速升高柱溫使其流出或用反吹法將其放空，這樣就可達到縮短分析時間的目的。盡管如此，要找一個合適的內(nèi)標物并不總是一件容易的事情，因為理想的內(nèi)標物的保留時間和響應因子應該與待測物盡可能接近，且要完全分離。此外，用內(nèi)標法定量時，樣品制備過程要多一個定量加入內(nèi)標物的步驟，標準樣品和未知樣品均要加入一定量的內(nèi)標物。因此，只要定量精度要求不高，就應避免使用內(nèi)標法。
至于標準加入法，是在未知樣品中定量加入待測物的標準品，然后根據(jù)峰面積（或峰高）的增加量來進行定量計算。其樣品制備過程與內(nèi)標法類似，但計算原理則完全是來自外標法。標準加入法的定量精度應該介于內(nèi)標法和外標法之間。
上述各種定量方法中，峰面積均可用峰高代替。理論上講，濃度型檢測器（如TCD，參見《氣相色譜檢測方法》）用峰高定量較準確，而質(zhì)量型檢測器用峰面積定量更準確。但在實際操作中，影響峰高和峰面積的因素有多種，不僅載氣流速和柱溫，而且檢測器的結(jié)構設計等均有影響。綜合考慮各種因素，峰面積定量一般比峰高定量準確一些。然而，當峰未完全分離時，面積積分準確度會下降，此時用峰高定量不失為一種合理的選擇。
到此為止，我們基本上完成了一個GC方法的開發(fā)。這個方法是否合理、可靠？是否能為同行所采用？還有待于對其進行驗證。圖5-1-4總結(jié)了GC方法開發(fā)的一般步驟。
來源：Internet
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