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反相色譜法中有種特殊的模式非水反相色譜法，在平時工作中應(yīng)用較少。但是非水反相色譜法能對疏水性很強、不溶于水樣品分離有很好的作用，本文對非水反相色譜法進行介紹，并對其使用范圍進行匯總分析。

一引言

1906年，俄國植物學(xué)家Tsweet將CaCO3固體粉末裝入豎立的玻璃管中，從頂端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚連續(xù)地沖洗。結(jié)果在柱中出現(xiàn)了顏色不同的色帶。因此，Tsweet把這種方法稱為色譜法。色譜法是一種分離方法，它的特點是有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。色譜法能夠分離的原理是利用被分離的物質(zhì)在互不相溶的兩相中分配系數(shù)等的微小差異進行分離。當兩相作相對移動時，使被測物質(zhì)在兩相之間進行反復(fù)多次分配，使原來微小的差異累加產(chǎn)生了很大的效果形成差速遷移，使各組分在柱內(nèi)移動的同時逐漸分離，以達到分離、分析及測定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的。按流動相狀態(tài)的不同，可分為：氣相色譜法(GC)，液相色譜法(LC)，超臨界流體色譜(SFC)。液相色譜法按固定相狀態(tài)的不同可分為：液固色譜(LSC)，液液色譜(LLC)。化學(xué)鍵合相色譜法（采用化學(xué)鍵合相作固定相的液相色譜法）是液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是利用化學(xué)反應(yīng)通過共價鍵將有機分子鍵合在載體(硅膠)表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相?；瘜W(xué)鍵合固定相對各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性?；瘜W(xué)鍵合相色譜所用流動相的極性須與固定相顯著不同，根據(jù)鍵合固定相和流動相相對極性的強弱 ，可將鍵合色譜法分為正相色譜法和反相色譜法。在正相色譜法中，鍵合固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物；在反相色譜法中，鍵合固定相的極性小于流動相的極性，適用于分離非極性物質(zhì)。在《現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論》第三版中，根據(jù)分離的模式或本質(zhì)將色譜模式分成以上幾種。

二非水性反相色譜

在上表的色譜模式中，反相色譜是目前最常用的模式。反相色譜法使用非極性的固定相或者色譜柱（如C18）和極性的流動相。極性的溶質(zhì)分子喜歡極性的流動相（物以類聚）且保留程度比較低，而非極性的溶質(zhì)分子會傾向和非極性的固定相相互作用并能保留更久。反相色譜法中易忽略的模式非水反相色譜（NARP），色譜柱是非極性（如C18），流動相顧名思義非水全部由有機相組成。非水反相色譜（NARP）中主要用來分離疏水性很強的樣品，這些樣品的保留能力很強，如脂類、合成聚合物等。非水反相色譜中的流動相是由極性較強的有機溶劑A和極性較弱的有機溶劑B組成。通常A溶劑常用的是乙腈或甲醇，B溶劑是四氫呋喃、異丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或者其他極性較弱的有機溶劑。樣品保留是通過改變%B或B溶劑的極性來控制的。可以通過下表的p’值近似估算溶劑的極性。

三原理

反相色譜法的保留機制長久以來都是研究重點。溶質(zhì)分子在固定相的定位可能有幾種形式存在，如疏溶劑作用、吸附作用、分配作用等。疏溶劑相互作用假定了溶質(zhì)分子與配合基對齊并且附著在它上面。吸附意味著溶質(zhì)分子并沒有滲透到固定相里面而是保留在固定相和流動相液體之間。分配作用為固定相和液體類似，溶質(zhì)分子溶解在里面。見下圖。

其中疏溶劑的作用是接受比較廣的理論：相對而言，疏水性的溶質(zhì)分子比較喜歡吸附在疏水性的烷基基團上，因此也叫疏水性保留。反相色譜法中鍵合的烷基等非極性固定相，流動相為水、有機溶劑、緩沖液等極性溶劑。鍵合相鏈越長、疏水性越強，溶質(zhì)的保留值越大；流動相表面張力越大、介電常數(shù)越大、極性越強，溶質(zhì)與鍵合相的作用越強，流動相的洗脫能力越差，溶質(zhì)保留值越大。溶質(zhì)的極性越弱，疏水性越強，保留值越大。

對于非水反相色譜法，原理和反相色譜法一致。固定相為非極性固定相。樣品由于疏水性較強，保留較大，不采用強極性水溶液作為流動相，全部由有機溶劑組成。

非水反相色譜法方法優(yōu)化同反相色譜法，主要通過改變%B或B溶劑的極性來調(diào)節(jié)，等度或梯度都能使用，同時柱溫對樣品的分離也有影響。一般采用首選采用ACN（A）和THF（B）的混合溶劑為作為初始流動相。若用100%THF樣品保留仍太強，可以用極性較弱B溶劑（如二氯甲烷或氯仿）來替換，但是應(yīng)考慮使用二氯甲烷或氯仿的檢測波長。

四使用范圍

下表對使用非水反相色譜法檢測文獻進行歸納整理。

從上表可以看出非水反相色譜法主要集中應(yīng)用于脂溶性、疏水性很強的化合物和一些非極性含氮有機化合物。脂溶性藥物極性小，不溶于水，有時甚至在甲醇中也難溶，一般采用正相色譜法和氣相色譜法。正相色譜法和氣相色譜法均有優(yōu)缺點，可以考慮使用非水反相色譜進行檢測。制劑中的一些水溶性成分或某些輔料不溶于有機相，對測定影響小。文獻中還報道了非水反相色譜法分離測定了幾種非極性含氮有機化合物及其鹽類藥物，有可能為非水反相色譜法非水體系減少了樣品的電離，減少含氮基團與固定相殘留硅醇基的作用，改善峰形。

在《Quantification of pentaerythritol tetrastearate，a mold release agent used in polycarbonate, by non‐aqueous RP HPLC method》中，聚對苯二甲酸乙二醇酯為一個高分子量和強疏水性物質(zhì)，氣相和正相色譜均不能檢測其含量，采用NAPR梯度和蒸發(fā)光散射檢測器的方法很好的解決了高分子量和強疏水性的問題。這為相似的化合物的檢測提供了解決思路。從上表可以看出非水反相色譜法主要集中應(yīng)用于脂溶性、疏水性很強的化合物和一些非極性含氮有機化合物。脂溶性藥物極性小，不溶于水，有時甚至在甲醇中也難溶，一般采用正相色譜法和氣相色譜法。正相色譜法和氣相色譜法均有優(yōu)缺點，可以考慮使用非水反相色譜進行檢測。制劑中的一些水溶性成分或某些輔料不溶于有機相，對測定影響小。文獻中還報道了非水反相色譜法分離測定了幾種非極性含氮有機化合物及其鹽類藥物，有可能為非水反相色譜法非水體系減少了樣品的電離，減少含氮基團與固定相殘留硅醇基的作用，改善峰形。

非水反相色譜法同時具有一定的局限性。由于流動相全為有機相，只能適用于疏水性強，溶于有機溶劑的樣品。如果檢測器為紫外檢測器，流動相如二氯甲烷等需要注意使用的檢測波長不能采用低波段。在使用非水反相色譜法時，需要將整個系統(tǒng)和色譜柱的水相徹底沖洗。

五結(jié)論

非水反相色譜法為反相色譜法的一種特殊模式，色譜柱同反相色譜法常用的非極性色譜柱，流動相全為有機相，樣品保留是通過改變極性較弱溶劑的極性來控制；主要分離疏水性很強、不溶于水的樣品。在平時工作中，遇到類似物質(zhì)可以考慮使用非水反相色譜法，不拘泥于紫外檢測器，如上文提到的檢測聚對苯二甲酸乙二醇酯采用蒸發(fā)光散射檢測器，同時還有報道采用LC-MS聯(lián)用等。

本文為筆者學(xué)習(xí)《現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論》第三版及一些文獻整理的讀書筆記，如有錯誤，敬請指出。

參考文獻

1. 人民衛(wèi)生出版社 《現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論》第三版

2. 郝曉花 非水反相液相色譜法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用

3. 劉紅菊 非水反相高效液相色譜法在非極性藥物分析中的應(yīng)用研究

4. 劉紅菊，蔣 曄，郝曉花 非水反相高效液相色譜法測定阿立哌唑的含量

5. Polasa Indira ，Kumar Arun ，Narayana Ramesh ，Quantification of pentaerythritol tetrastearate，a mold release agent used in polycarbonate by non‐aqueous RP HPLC method