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本文主要介紹了湖南萊拓福生物科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

一、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的產(chǎn)品主要組成成分

本檢測試劑由校準(zhǔn)品（6瓶/組）、生物素標(biāo)記物、銪標(biāo)記物、濃縮洗液、生物素標(biāo)記物緩沖液、銪標(biāo)記物緩沖液、包被酶標(biāo)板、增強(qiáng)液、校準(zhǔn)品稀釋液、封片、自封袋組成。 其中包被酶標(biāo)板上包被有兔抗AKR1B10多克隆抗體，生物素標(biāo)記物為生物素標(biāo)記鼠抗AKR1B10單克隆抗體。

二、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的產(chǎn)品預(yù)期用途

用于體外定量檢測人血清中AKR1B10的含量。臨床主要用于對確診且術(shù)前AKR1B10陽性的原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌手術(shù)患者進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測以輔助判斷疾病進(jìn)程或手術(shù)治療效果，不能作為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌早期診斷或確診的依據(jù)，不用于普通人群的腫瘤篩查。

三、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的產(chǎn)品包裝規(guī)格

96人份/盒。 

四、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

試劑盒采用雙抗體夾心時間分辨熒光免疫分析法 （IFMA法）定量檢測人血清中AKR1B10蛋白濃度。以兔抗AKR1B10多克隆抗體包被反應(yīng)板，用生物素（Biotin）標(biāo)記鼠抗AKR1B10單克隆抗體做檢測抗體，用銪標(biāo)記鏈霉親和素（Streptavidin-Eu）作為發(fā)光標(biāo)記物。 

檢測時，將待測樣本加入反應(yīng)板微孔，樣本中的AKR1B10與包被于微孔表面的兔抗AKR1B10多克隆抗體結(jié)合。洗滌后，加入生物素標(biāo)記鼠抗AKR1B10單克隆抗體，鼠抗AKR1B10單克隆抗體與結(jié)合在反應(yīng)板上的AKR1B10蛋白結(jié)合，洗滌后，加入銪標(biāo)記鏈霉親和素，銪標(biāo)記鏈霉親和素與結(jié)合在反應(yīng)板上的鼠抗AKR1B10單克隆抗體上標(biāo)記的生物素反應(yīng)，在微孔表面形成免疫復(fù)合物：兔抗AKR1B10多克 

隆抗體-AKR1B10蛋白-鼠抗AKR1B10單克隆抗體-Biotin Streptavidin-Eu。洗滌除去游離的銪標(biāo)記鏈霉親和素，加入增強(qiáng)液將復(fù)合物上的Eu3+解離到溶液中，并與增強(qiáng)液中的有效成份形成高熒光強(qiáng)度的螯合物，其熒光強(qiáng)度與樣本中的 AKR1B10蛋白濃度成正比。通過劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣 本AKR1B10濃度值。 

五、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的主要原材料的選擇

本產(chǎn)品的主要原材料包括：銪標(biāo)記鏈霉親和素、醛酮還原酶1B10（AKR1B10）抗原、兔抗AKR1B10多克隆抗體、生物素標(biāo)記鼠抗AKR1B10單克隆抗體，其中醛酮還原酶1B10抗原、兔抗AKR1B10多克隆抗體、生物素標(biāo)記鼠抗AKR1B10單 克隆抗體為 萊拓福自行研制生產(chǎn)，其余原材料均為外購方式獲得。 萊拓福選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供的原料，通過功能性試驗(yàn)，篩選出最佳原材料和合格供應(yīng)商，并制定了各主要原 材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

六、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的企業(yè)參考品設(shè)置情況

萊拓福設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品，包括線性參考品、空白限參考品、重復(fù)性參考品、準(zhǔn)確度參考品、特異性參考品。 

具體如下： 

線性參考品1份，為臨床陽性樣本，經(jīng)添加稀釋的AKR1B10抗原溶液制備而成，濃度為5700~6000pg/mL。 

空白限參考品1份，為校準(zhǔn)品稀釋液。 

重復(fù)性參考品2份，為臨床陽性樣本，經(jīng)添加稀釋的AKR1B10抗原溶液制備而成，濃度分別為1800~2200pg/mL 和900~1100pg/mL。 

準(zhǔn)確度參考品2份，為臨床陽性樣本，經(jīng)添加稀釋的AKR1B10抗原溶液制備而成，濃度分別為4000~5000pg/mL 和0~500pg/mL。 

特異性參考品2份，為市售的AFP、CEA抗原，用稀釋緩沖 液 稀 釋 制 備 而 成 ， AFP 特 異 性 參 考 品 濃 度 為1000±100ng/mL，CEA特異性參考品濃度為100±10ng/mL。 

七、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

萊拓福通過對試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生產(chǎn)工藝。 萊拓福對反應(yīng)體系研究包括樣本要求、樣本用量、試劑用量、各檢測步驟的反應(yīng)時間、洗滌次數(shù)等，通過一系列研究，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。通過10份不同濃度的AKR1B10陽性血清樣本體外37℃模擬實(shí)驗(yàn)研究確定，標(biāo)志物的半衰期為22.3h。 

八、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的產(chǎn)品分析性能評估

本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括外觀、線性、空白限、精密度、準(zhǔn)確度、特異性、干擾因素的評估等。 萊拓福提交了三批產(chǎn)品在適用機(jī)型上的性能評估資料。在線性性能評估中， 萊拓福對線性參考品與低值血清或生理鹽水等比稀釋6個濃度水平的樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示 

本產(chǎn)品在105pg/mL~6000pg/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r不低于0.9900，符合要求。在空白限性能評估中， 萊拓福對空白限參考品重復(fù)測定20次，計(jì)算濃度值，最終確定并驗(yàn)證本試劑盒的空白限為100pg/mL。 在精密度性能評估中， 萊拓福對不同濃度的參考品（含 

高值、低值和cutoff值附近濃度值）進(jìn)行檢測，分別評估了批內(nèi)、批間、室內(nèi)、室間、日內(nèi)、日間、不同操作者、不同儀器之間的精密度。結(jié)果顯示：檢測結(jié)果的變異系數(shù)（CV值）均不高于10.0%，表明本產(chǎn)品的批內(nèi)、批間、室內(nèi)、室間、日內(nèi)、日間、不同操作者、不同儀器之間的重復(fù)性均符合要求。在準(zhǔn)確度性能評估中， 萊拓福對準(zhǔn)確度參考品（含高值和低值兩個濃度水平）按比例混合，進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率， 符合要求。 

在特異性性能評估中， 萊拓福對兩個特異性參考品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示檢測結(jié)果均不高于100pg/mL，符合要求。在干擾因素的性能評估中， 萊拓福對常見干擾物質(zhì)（溶血、脂血、黃疸、生物素）、自身免疫性抗體（類風(fēng)濕因子、抗核抗體、人抗鼠抗體）、結(jié)構(gòu)相似的蛋白（AKR1B1）、常見抗腫瘤藥物（索拉非尼、奧沙利鉑、表柔比星）、常見解熱抗炎藥物（阿司匹林）、常見病原體（乙型肝炎表面抗原）、肝部異常常規(guī)檢測相關(guān)生物標(biāo)志物（甲胎蛋白）、腸道異常常規(guī)檢測相關(guān)生物標(biāo)志物（癌胚抗原、糖類抗原19-9）等進(jìn) 

行了研究。 

結(jié)果顯示：低于表1中濃度指標(biāo)的干擾物質(zhì)不會對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾；抗核抗體ANA不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；人抗鼠抗體（HAMA）、類風(fēng)濕因子（RF）對本產(chǎn)品有干擾。

九、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的陽性判斷值研究

萊拓福采用ROC曲線法確定陽性判斷值。 萊拓福用本產(chǎn)品對107例臨床病理確診為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)前血清標(biāo)本和447例健康人血清標(biāo)本，30例乙型肝炎標(biāo)本，30例其他肝部良性疾病標(biāo)本，30例肝硬化標(biāo)本，30例轉(zhuǎn)移性肝癌標(biāo)本，進(jìn)行檢測，采用受試者工作特征（ROC）曲線方法確定臨界值（cutoff）為215pg/mL。 

 萊拓福另對201例健康人血清樣本進(jìn)行檢測，其檢測數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，血清AKR1B10檢測結(jié)果P95為213.225 pg/mL，經(jīng)四舍五入后確定95%＜213 pg/mL。

十、醛酮還原酶 1B10 測定試劑盒 （時間分辨熒光免疫分析法）的穩(wěn)定性研究 

萊拓福對本產(chǎn)品的實(shí)時穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性等進(jìn)行了研究，確定了各種條件下本產(chǎn)品的有效保存時間；同時對不同溫度儲存條件下臨床樣本儲存穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了各種儲存條件下臨床樣本的有效保存時間及凍 

融次數(shù)。 

產(chǎn)品實(shí)時穩(wěn)定性研究：采用三批試劑進(jìn)行研究，試劑保存在2~8℃條件下，分別保存0、1、2、3、6、9、11、12、13、 14個月時取出，對試劑盒外觀、線性、空白限、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和特異性進(jìn)行考察，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求。因此確定申報(bào)產(chǎn)品的效期穩(wěn)定性為：2~8℃保存，有效期為12個月。 

樣本穩(wěn)定性：采用10個不同濃度的臨床血清樣本分別放置在-80℃、-20℃、2~8℃、20~25℃條件下存放一定時間后取出，用本產(chǎn)品檢測樣本中AKR1B10濃度，與血清初濃度相比較，看濃度是否發(fā)生明顯變化，以確定在對應(yīng)溫度儲存條件下的樣本穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：血清樣品在20~25℃環(huán)境下可以保存8小時，在2～8℃環(huán)境下可以保存7天；如果需要長期保存，則建議在-80℃或-20℃環(huán)境下保存（-20℃環(huán)境下可以 保存12個月）。