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一、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑漠a(chǎn)品主要組成成分

二、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑漠a(chǎn)品預(yù)期用途

本 試 劑 盒 用 于 體 外 檢 測(cè) 人 外 周 血 血 漿 中 SHOX2 、RASSF1A、PTGER4 基因的甲基化。 

本產(chǎn)品用于臨床上對(duì)疑似肺癌患者的輔助診斷，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性不作為肺癌早期診斷或確診的證據(jù)，檢測(cè)結(jié)果陰性也不能 

排除肺癌的可能。該檢測(cè)不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)，不宜用于普通人群的腫瘤篩查。SHOX2 屬于 SHOX 基因家族，在胚胎形成期對(duì)骨骼、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育作用重大，在肺癌、乳腺癌和腎癌中異常表達(dá)。RASSF1A 調(diào)控涉及基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能，可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤形成。PTGER4 屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族，是非常重要的抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿樣本中 SHOX2、RASSF1A 及 PTGER4三基因啟動(dòng)子區(qū)域呈高度甲基化。

三、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑陌b規(guī)格

30 人份/盒。 

四、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑漠a(chǎn)品檢驗(yàn)原理

提取血漿中的游離 DNA，然后用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化未發(fā)生甲基化的胞嘧啶，通過(guò)脫氨基反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶磺酸鹽，發(fā)生甲基化的胞嘧啶則不會(huì)被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的 DNA（BisDNA）做多重 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)中的引物、探針能區(qū)分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優(yōu)先得到擴(kuò)增，與甲基化 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 基因序列特異性結(jié)合的熒光素探針可以在 PCR 反應(yīng)中專一地檢測(cè)出甲基化序列。內(nèi)參對(duì)照ACTB（β-actin）基因用于評(píng)估檢測(cè)中 DNA 量是否足夠。

五、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑闹饕牧系倪x擇

本產(chǎn)品的主要原材料包括引物干粉、PCR反應(yīng)液、人類基因組DNA和Hela細(xì)胞基因組DNA。這些原料均是通過(guò)外購(gòu)的方 式獲得。 

其中引物的序列均由艾克倫醫(yī)療自行設(shè)計(jì)，由合成公司經(jīng)過(guò)合成、修飾、純化方式獲得；PCR反應(yīng)液由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得；人類基因組DNA和Hela細(xì)胞基因組DNA由供應(yīng)商提取純化獲得。 

艾克倫醫(yī)療對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。 

六、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑钠髽I(yè)參考品設(shè)置情況 

本產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測(cè)限參考品，組成如下：陽(yáng)性參考品包括 12種。P1、P2、P3為一定 DNA 濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均為甲基化的不同甲基化比例的參考品；SP1、SP2、SP3為一定 DNA 濃度不同比例的SHOX2單甲基化參考品；RP1、RP2、RP3為一定 DNA 濃度不同比例的RASSF1A單甲基化參考品；PP1、PP2和PP3為一定DNA 濃度不同比例的PTGER4單甲基化參考品。陰性參考品包括 4種，包括三種不同DNA濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4均無(wú)甲基化的參考品，一種三基因均甲基化但甲基化比例低于檢測(cè)限的陰性參考品。精密度參考品包括6種。J1、J2為一定DNA 濃度，SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。SJ1、SJ2為一定DNA 濃度，SHOX2單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。RJ1、RJ2為一定DNA 濃度，RASSF1A單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。PJ1、PJ2 為一定DNA 濃度，PTGER4基因單甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。 

檢測(cè)限參考品包括 4 種。包括低 DNA 濃度的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4三基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的 SHOX2單基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的RASSF1A單基因 甲基化參考品，低 DNA 濃度的 PTGER4單基因甲基化參考品。 

七、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑纳a(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究 

艾克倫醫(yī)療對(duì)試劑盒反應(yīng)體系的研究中包括引物探針濃度的確定、PCR 反應(yīng)液的選擇、陰/陽(yáng)性質(zhì)控品配方的確定等；對(duì)PCR過(guò)程中的退火溫度進(jìn)行研究；完成樣本的用量以及樣本保存時(shí)間 的 研 究 ； 對(duì) 該 產(chǎn) 品 三 種 適 用 機(jī) 型 宏 石 PCR 分 析 系 統(tǒng)SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480的反應(yīng)程序及分析條件進(jìn)行了研究。通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。艾克倫醫(yī)療根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。 

八、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑姆治鲂阅茉u(píng)估研究

本產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括：準(zhǔn)確性（陽(yáng)性符合率、陰性符合率）、精密度、檢測(cè)限、分析特異性的評(píng)估；核酸提取試劑的性能評(píng)估；三種適用的 PCR 儀機(jī)型（宏石 PCR 分析系統(tǒng)SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480）評(píng)估。 

準(zhǔn)確性研究使用企業(yè)陰/陽(yáng)性參考品及臨床樣本來(lái)源的陰性 /陽(yáng)性/弱陽(yáng)性樣本池分別對(duì)三個(gè)批次的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性符合率 100%、陰性符合率 100%。同時(shí)用試劑盒與 同類對(duì)比試劑分別檢測(cè)臨床樣本，包括各期肺癌樣本共 128 例及肺結(jié)核樣本 32 例，結(jié)果顯示試劑盒對(duì)于Ⅰ~Ⅳ期肺癌和肺結(jié)核樣本監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確率分別為 78.13%、87.50%、84.38%、87.50%和81.25%。 

精密度的研究使用了兩種不同的樣本，第一種樣本是精密度參考品，對(duì)三批次試劑盒分別在三種適用的儀器上進(jìn)行檢測(cè)。 檢測(cè)結(jié)果顯示試劑盒檢測(cè)的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 和ACTB 基因的變異系數(shù)均小于 10%。第二種樣本是通過(guò)在臨床正常人血漿樣本中添加一定濃度的細(xì)胞系 DNA 模擬精密度企業(yè)參考品進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果顯示 SHOX2、RASSF1A、PTGER4和 ACTB 基因的變異系數(shù)均小于 10%。同時(shí)也對(duì)配套用核酸提取試劑的精密度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在樣本采集過(guò)程、核酸提取過(guò)程中 DNA 提取量變異系數(shù)小于 10%；核酸轉(zhuǎn)化過(guò)程中，ACTB 基因 Ct 值的變異系數(shù)均小于 10%。檢測(cè)限研究，以陰性血漿樣本為基質(zhì)，對(duì)不同游離 DNA 濃度下含有不同比例甲基化 DNA 的血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，得到血漿樣本的檢測(cè)限，并在三種適用機(jī)型上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明試劑盒可檢測(cè)血漿中陽(yáng)性 DNA 最低濃度為 0.1pg/µL。在血漿 DNA濃度為 0.02ng/µL 時(shí)，產(chǎn)品檢測(cè) P 值為陽(yáng)性的檢測(cè)限為 0.5%三基因甲基化，單基因甲基化的檢測(cè)限分別為 0.2%的 SHOX2 甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。使用三批試劑盒對(duì)四種檢測(cè)限參考品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果表明對(duì)于DNA濃度為0.02ng/µL的參考品，P值為陽(yáng)性的檢測(cè)限為0.5%的三基因甲基化，單基因甲基化的檢測(cè)限分別為 0.2%的 SHOX2甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。 

特異性研究，交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明試劑盒檢測(cè)干擾樣本的綜合特異性超過(guò) 85%。對(duì)于發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的其它原發(fā)癌癥（包括肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌）檢出率較低，假陽(yáng)性率低于 25%，說(shuō)明產(chǎn)品僅適用于原發(fā)性肺癌的檢測(cè)。檢測(cè)自身免疫性疾病包括紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特異性超過(guò) 90%，假陽(yáng)性率低于 10%。檢測(cè)其它肺部疾病的特異性超過(guò) 85%，假陽(yáng)性率低于 15%。檢測(cè)宮頸癌特異性為 80%，假陽(yáng)性率為 20%。 干擾實(shí)驗(yàn)顯示，樣本中含有以下干擾物：未甲基化 DNA （150ng/ml）、膽紅素（0.20mg/ml）、血紅蛋白（10mg/ml）、甘油三酯（12mg/ml）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml）、紅細(xì)胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/ml）、膽固醇（5mg/ml）、尿酸（0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml），對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。常見(jiàn)治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮(zhèn)痛藥等在最大使用劑量范圍內(nèi)，不影響試劑盒對(duì)樣本檢測(cè)的 Ct 值及 P 值判定。 

對(duì)與試劑盒聯(lián)合使用并在說(shuō)明書(shū)中推薦的血漿樣本處理試劑（核酸提取試劑，京昌械備 20180004 號(hào)，北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行了性能評(píng)估，結(jié)果表明產(chǎn)品配套使用的核酸提取試劑，提取效率、保護(hù)效率和轉(zhuǎn)化效率分別為 85.18%、93.52%和 99.32%。 

對(duì)該產(chǎn)品適用的三種儀器宏石 PCR 分析系統(tǒng) SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480 進(jìn)行了性能評(píng)估，結(jié)果顯示在三種適用機(jī)型上的陰/陽(yáng)性符合率、檢測(cè)限、精密度均符合質(zhì)量要求，可以作為該產(chǎn)品的檢測(cè) PCR 儀。 

九、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑年?yáng)性判斷值研究 

艾克倫醫(yī)療采用三基因擬合 P 值公式法確定陽(yáng)性判斷值。每個(gè)樣本進(jìn)行 3 次 PCR 平行測(cè)試，計(jì)算 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 和 ACTB 基因 3 個(gè)復(fù)孔平均 Ct 值，其中各個(gè)基因無(wú)擴(kuò)增時(shí)，Ct值定義為 45.0。ACTB 基因的 Ct 值≤35.0 時(shí)，樣本檢測(cè)結(jié)果有效。在確定樣本檢測(cè)結(jié)果有效的情況下，樣本 P 值≥2.0 則判斷樣本為陽(yáng)性，樣本 P 值＜2.0 則判斷樣本為陰性。 

陽(yáng)性判斷值研究入組（訓(xùn)練集和驗(yàn)證集）有效樣本數(shù)共計(jì)489 例，包括肺部正常樣本 207 例、肺癌病人樣本 141 例、其它干擾樣本（包括結(jié)節(jié)、肺炎、肺結(jié)核、囊腫、食管癌、胃癌等）141 例。樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行多種方法統(tǒng)計(jì)分析，包括 1/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、2/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、3/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、3 次PCR 反應(yīng)平均 Ct 值、單基因、兩基因、三基因、三基因組合擬合公式等，比較不同分析方法的檢測(cè)靈敏度、特異性、總符合率，最終確定使用三基因擬合 P 值公式法檢測(cè)準(zhǔn)確率最高。并使用測(cè)試集樣本再次驗(yàn)證三基因擬合公式和其他陽(yáng)性判斷值方 法，測(cè)試集研究入組有效例數(shù) 248 例，包括肺部正常人樣本 81例，肺癌病人樣本 76 例，其他干擾樣本 91 例。結(jié)果表明三基因擬合 P 值公式法特異性為 94.19%（95%CI：90.65%-97.72%），靈敏度為 89.47%（95%CI：82.41%-96.53%），總符合率為 92.74% （95%CI：89.49%-95.99%）。 

十、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┑姆€(wěn)定性研究 

艾克倫醫(yī)療對(duì)該產(chǎn)品的穩(wěn)定性的研究包括長(zhǎng)期穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性（包括開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性）及樣本穩(wěn)定性（包括全血、血漿及 BisDNA 的穩(wěn)定性）。 

長(zhǎng)期穩(wěn)定性：選擇三批次試劑盒置于-20±5℃冰箱中保存，在儲(chǔ)存后的第 0、3、6、9、12、13、14、15 個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示產(chǎn)品在生產(chǎn)后 15 個(gè)月的產(chǎn)品性能符合技術(shù)要求，試劑性能穩(wěn)定。確定產(chǎn)品有效期可達(dá) 12 個(gè)月。 

使用穩(wěn)定性：將三批試劑盒置于-20±5℃開(kāi)瓶放置 6 周后，穩(wěn)定性結(jié)果 P 值及 CV 值均無(wú)顯著差異，無(wú)顯著變化趨勢(shì)，其產(chǎn)品的主要性能均符合技術(shù)要求。將三批次試劑盒在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下，取出試劑盒反復(fù)凍融 6 次，檢測(cè)每次凍融后的試劑盒的性能均符合技術(shù)要求。將三批試劑盒置于 37℃，分別于 1天、2 天、3 天后檢測(cè)產(chǎn)品性能，均符合技術(shù)要求。 

艾克倫醫(yī)療對(duì)全血樣本、血漿樣本及 BisDNA 的樣本穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明使用 EDTA 抗凝管（BDVacutainer®， 6mL，國(guó)械注進(jìn) 20152222083）采集全血，建議選用 2-8℃放置 4 小時(shí)以內(nèi)的新鮮血樣分離血漿后用于檢測(cè)；使用康為游離 DNA 采血管（康為世紀(jì)，5mL，蘇械注準(zhǔn) 20192220059）采集全血，建議選用室溫放置 4 天以內(nèi)的血樣分離血漿后用于檢測(cè)。分離后的血漿樣本建議在-20±5℃保存 30 天以內(nèi)，在 2-8℃保存12 小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；BisDNA 保存期限為在-20±5℃保存 4 天以內(nèi)，在 2~8℃保存 16 小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。