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為了保證藥品的質(zhì)量可控性，需要有基于“QbD”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及對應(yīng)的分析檢測方法，然而在應(yīng)用擬定的分析方法進(jìn)行定量分析中，檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，經(jīng)過一系列的偏差調(diào)查發(fā)現(xiàn)原因沒找到的時候，需要排查的一個重要因素是定量方法。

 

一 定量方法的概述

 

內(nèi)標(biāo)法：首先計(jì)算校正因子，根據(jù)校正因子計(jì)算供試品的量，具體公式如下：

 

 

外標(biāo)法：包括外標(biāo)一點(diǎn)法，自身對照法（加校正因子和不加校正因子），其中外標(biāo)一點(diǎn)法采用對照品和供試品的峰面積和濃度進(jìn)行含量的計(jì)算，公式如下：

 

 

通常校正因子在0.9-1.1之間或者無法獲得校正因子時直接應(yīng)用自身對照法進(jìn)行雜質(zhì)限量計(jì)算，如果校正因子不在規(guī)定范圍內(nèi)，需要增加校正因子進(jìn)行計(jì)算，校正因子的公式如下：

 

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：先計(jì)算濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)供試品的響應(yīng)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算供試品的量，公式如下：

 

 

面積歸一化法：測量各峰和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。

標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法：配制適當(dāng)濃度的對照品溶液加入供試品溶液中，然后利用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算待測成分的含量，公式如下：

 

 

二“測不準(zhǔn)”的案例

 

案例一：HPLC-ELSD方法中外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算的含量不準(zhǔn)。

 

信息1：SD1、SD2、SD3的濃度分別為：0.01263mg/ml、0.02526mg/ml、0.030312 mg/ml；對應(yīng)的峰面積A1、A2、A3分別為：2834.148、7633.898、9129.124；

信息2：供試品進(jìn)樣分析后的峰面積AX為6009.84；

結(jié)果1：以C（mg/ml）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)線性回歸：y=360629.12x-1666.15，以對照濃度0.02526mg/ml進(jìn)行外標(biāo)一點(diǎn)法定量計(jì)算Cx=0.01989mg/ml；

結(jié)果2：以lgC為橫坐標(biāo)，lgA為縱坐標(biāo)線性回歸：y=1.361x+6.041，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法將lgAX帶入線性方程后計(jì)算Cx=0.02177mg/ml；

討論：Cx=0.01989mg/ml與Cx=0.02177mg/ml相比，差了約8%。

ELSD是通用型檢測器，適用于無需具有光吸收特性的物質(zhì)，如磷脂、糖類等物質(zhì)的測定。ELSD的檢測原理是待測物隨著流動相進(jìn)入霧化室內(nèi)，被霧化成小液滴，被載氣帶入漂移管內(nèi)，流動相被蒸發(fā)，待測物以溶質(zhì)顆粒的狀態(tài)發(fā)生光散射，然后以光電倍增或光電二極管轉(zhuǎn)換信號進(jìn)行檢測。在ELSD的方法中通常應(yīng)用對數(shù)相關(guān)的方式進(jìn)行線性回歸，因?yàn)樵贓LSD的檢測過程中隨著濃度的增加，信號響應(yīng)的方差可能會隨之增大，為了使方差恒定，可以采用濃度和峰面積取對數(shù)后的線性回歸，并且在實(shí)際供試品含量計(jì)算時需要帶入線性方程進(jìn)行計(jì)算，在ELSD的方法中不宜采用單點(diǎn)外標(biāo)，至少兩點(diǎn)一線的曲線法進(jìn)行定量計(jì)算。

 

案例二：離子色譜法檢測某陰離子時應(yīng)用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算回收率不合格。

 

信息1：SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7的濃度分別為：3.2330μg/ml、5.1728μg/ml、6.4660μg/ml、7.7592μg/ml、9.6990μg/ml、12.9320μg/ml、16.1650μg/ml；對應(yīng)的峰面積A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7分別為：0.2658、0.4186、0.5156、0.6082、0.7483、0.9742、1.1803；

信息2：供試品進(jìn)樣分析后的峰面積A本底為0.5018；回收率試驗(yàn)中峰面積A低為0.878；回收率試驗(yàn)中峰面積A中為0.958；回收率試驗(yàn)中峰面積A高為1.042；

信息3：回收率的可接受標(biāo)準(zhǔn)為95%-102%；

結(jié)果1：以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算，對照濃度6.4660μg/ml，峰面積0.5156；計(jì)算得本底濃度6.2929μg/ml；回收率試驗(yàn)中低91.2%、中88.5%、高87.3%，回收率均不符合要求；

結(jié)果2：以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，以C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)線性回歸：y=0.070x+0.053；計(jì)算得本底濃度6.4114μg/ml；回收率試驗(yàn)中低96.2%、中99.2%、高100.5%，回收率均不符合要求；

討論：在離子色譜法中標(biāo)準(zhǔn)曲線法的準(zhǔn)確度符合要求，離子色譜中電導(dǎo)檢測器，靈敏度較高，容易受到離子干擾，在定量計(jì)算中不適宜選擇外標(biāo)一點(diǎn)法。

 

案例三：GC法檢測API中的殘留溶劑時應(yīng)用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算回收率不合格。

 

信息1：SD1、SD2、SD3、SD4、SD5的濃度分別為：25.05μg/ml、40.08μg/ml、50.10μg/ml、60.12μg/ml、75.15μg/ml；對應(yīng)的峰面積A1、A2、A3、A4、A5分別為：53.18、85.62、104.58、127.52、158.96；

信息2：回收率試驗(yàn)中濃度進(jìn)樣分析峰面積為73.21；

信息3：標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法制備供試品的回收率中濃度進(jìn)樣分析峰面積為105.24；

結(jié)果1：以C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)線性回歸：y=2.108x+0.334，在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，用50.10μg/ml對應(yīng)的峰面積104.58以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算回收率為70.0%，不符合要求。

結(jié)果2：采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法計(jì)算回收率為100.6%；

討論：在GC法檢查殘留溶劑中，因?yàn)锳PI的存在很容易發(fā)生基質(zhì)效應(yīng)，為了避免基質(zhì)效應(yīng)帶來的測量誤差，可以采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法進(jìn)行定量。

 

案例四：HPLC法檢測有關(guān)物質(zhì)時應(yīng)用外標(biāo)法重復(fù)性結(jié)果的RSD大于10%。

 

信息1：供試品在制備過程中經(jīng)氮吹復(fù)溶離心后上清液進(jìn)樣分析，雜質(zhì)Ⅰ在供試品1、供試品2、供試品3、供試品4、供試品5、供試品6中的峰面積分別為293.224、367.666、313.320、355.254、311.634、288.539；

信息2：對照品溶液濃度5.0212μg/ml，對應(yīng)的峰面積為360.24；

信息3：在供試品制備中加入內(nèi)標(biāo)物S，內(nèi)標(biāo)的濃度10.2481，對應(yīng)的峰面積為354.18；內(nèi)標(biāo)和雜質(zhì)Ⅰ在供試品1、供試品2、供試品3、供試品4、供試品5、供試品6中的峰面積分別為292.712、363.099、303.804、337.099、312.702、283.771和294.234、368.686、312.35、345.154、316.614、289.529；

結(jié)果1：外標(biāo)法計(jì)算重復(fù)性的RSD為10.2%；

結(jié)果2：內(nèi)標(biāo)法計(jì)算重復(fù)性的RSD為0.8%；

討論：供試品制備過程復(fù)雜容易出現(xiàn)含量測不準(zhǔn)，在定量方法的選擇中外標(biāo)法存在測量結(jié)果不穩(wěn)定的劣勢，此時引入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，以內(nèi)標(biāo)法定量可以使測量結(jié)果更準(zhǔn)確。

 

三定量方法的合適應(yīng)用“場景”

 

外標(biāo)法：適用于有雜質(zhì)對照品，檢測器的專屬性很強(qiáng)的方法，并且在規(guī)定的線性范圍內(nèi)應(yīng)用?？蓱?yīng)用在HPLC-UV法的含量測定、雜質(zhì)定量檢查等方法中。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：適用于濃度范圍較大，如50或100倍，需要在高低濃度區(qū)域內(nèi)設(shè)置相應(yīng)的濃度點(diǎn)進(jìn)行線性回歸，供試品的響應(yīng)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。可應(yīng)用在離子色譜法、HPLC-ELSD法、包封率測定、溶出曲線的測定、體內(nèi)藥物分析等方法中。

內(nèi)標(biāo)法：適用進(jìn)樣及樣品制備過程容易引入誤差的方法中，可應(yīng)用在GC中手動進(jìn)樣，供試品的制備過程復(fù)雜、微量物質(zhì)分析等方法中。

標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法：適用于基質(zhì)效應(yīng)明顯的方法中，可應(yīng)用在GC殘留溶劑檢查、體內(nèi)藥物分析等方法中。

面積歸一化法：適用于非微量物質(zhì)分析，對檢測波長的要求較高，需要供試品中的物質(zhì)全部出峰。應(yīng)用于無法獲得對照品或者小試研究階段的雜質(zhì)分析方法中。

綜上所述，在藥物研發(fā)的分析檢測過程中，發(fā)生測定結(jié)果偏離理論值很遠(yuǎn)，方法學(xué)驗(yàn)證項(xiàng)目不符合要求等情況，研究者在審視方法、儀器、系統(tǒng)誤差的同時，需要關(guān)注一下是否定量方法的選擇是合適的，本人結(jié)合工作中的案例淺析了定量方法的選擇條件，希望和廣大同行共同討論學(xué)習(xí)。

 

參考文獻(xiàn)：

 

《中國藥典》2020年版第四部.