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蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來，是非常復(fù)雜的過程，有哪些坑，跟小編一起來看看吧。

 

蛋白純化原則

 

蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。

 

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。一般蛋白純化采用的方法為樹脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬，并可以迅速將蛋白與污染物分開，必要時(shí)可加入相應(yīng)的保護(hù)劑（例如蛋白酶抑制劑），防止目的蛋白被降解。

 

精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結(jié)合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個(gè)從樹脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

 

程序

 

分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)三步。

 

前處理

 

分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。為此，動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢⒔M織和細(xì)胞破碎。動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較麻煩，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個(gè)借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。

 

如果所要的蛋白主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。

 

粗分離

 

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。

 

細(xì)分離

 

樣品經(jīng)粗分級(jí)分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。

 

結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶過程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過程中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白，因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。

 

離子層析法

 

當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH等辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。

 

有機(jī)溶劑提取

 

蛋白質(zhì)純化有機(jī)溶劑提取的原理是：與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。

 

例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀，而且伴隨著變性。因此,通常要將有機(jī)溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過高,蛋白質(zhì)變性問題就可以很大程度上得到解決。對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。

 

避坑指南

 

樣品中的 DNA/RNA 等核酸雜質(zhì)污染難以去除？

 

a. 延長超聲時(shí)間以降低粘度。也可以使用核酸酶如 Benzonase 同時(shí)消化 DNA 和 RNA。如果來源是大腸桿菌裂解液，含有大量的 DNA，可以用鏈霉素沉淀等方法，預(yù)先去除大量的 DNA。

b. 通過層析方法去除：由于核酸帶負(fù)電，在陰離子柱上會(huì)結(jié)合或陽離子柱上流穿，也可有效去除核酸。

 

蛋白老也不掛柱？

 

a. 超聲功率不恰當(dāng)：過大使得蛋白碳化，過小蛋白沒有釋放。建議調(diào)整超聲功率或超聲前添加溶菌酶增加細(xì)胞破碎率。

b. 緩沖液條件不合適：緩沖液中 EDTA、檸檬酸等金屬離子螯合劑濃度不能過高，也可以適當(dāng)提高 pH。

c. His 標(biāo)簽未充分暴露：在蛋白中加入適量的尿素或鹽酸胍等變性劑純化或上游分子水平改變 His 的長度或位置使其暴露在蛋白表面。

d. His 標(biāo)簽未充分暴露：在蛋白中加入適量的尿素或鹽酸胍等變性劑純化或上游分子水平改變 His 的長度或位置使其暴露在蛋白表面。

e. 柱子過載：更換大體積柱子或多柱串聯(lián)。

 

蛋白掛柱后洗脫不下來？

 

a. 洗脫條件太溫和：增加緩沖液中咪唑濃度或者適當(dāng)降低緩沖液 pH。

b. 非特異性的疏水或者其他相互作用：加入非離子去污劑或者增加 NaCl 的濃度。

c. 蛋白沉淀：適當(dāng)降低上樣量或蛋白濃度，用咪唑線性洗脫；使用添加劑或者改變 NaCl 的濃度，或者在變性的條件下洗脫。

 

蛋白洗脫后雜質(zhì)好多？

 

a. 蛋白酶降解部分目的蛋白：添加蛋白酶抑制劑改進(jìn)

b. 雜蛋白與洗脫柱親和力高：優(yōu)化咪唑濃度或改善 pH、NaCl 濃度

c. 雜質(zhì)蛋白與目的蛋白相互作用：超聲前加入去垢劑或還原劑減少非特異性作用

 

隨著分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、基因組學(xué)等研究的不斷深入，人們意識(shí)到僅僅依靠基因組的序列分析來試圖闡明生命活動(dòng)的現(xiàn)象和本質(zhì)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。只有從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對(duì)所有蛋白質(zhì)的總和進(jìn)行研究，才能更科學(xué)地掌握生命現(xiàn)象和活動(dòng)規(guī)律，更完善地揭示生命的本質(zhì)。