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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-02-27 22:12
摘要
頭孢菌素是臨床應(yīng)用最廣泛的一類抗生素，其藥品中潛在的微量或痕量水平毒性雜質(zhì)，在用藥過程中可能會(huì)威脅到人類的健康，越來越受到制藥企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的關(guān)注。
對(duì)微量或痕量水平雜質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)，給藥品研發(fā)和監(jiān)管過程提出了巨大的挑戰(zhàn)，也成為藥物分析領(lǐng)域的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容。
近年來，隨著毒理學(xué)研究策略和技術(shù)方法的不斷進(jìn)步以及雜質(zhì)研究要求的不斷提高，雜質(zhì)毒性的研究策略與方法也需要更加具有預(yù)測(cè)性和精確性。
本文探討了頭孢菌素雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)所采用的雜質(zhì)毒性研究策略和方法，尤其是以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的計(jì)算機(jī)模擬技術(shù);
同時(shí)重點(diǎn)提出了模式生物斑馬魚、LC-MS /MS 技術(shù)和系統(tǒng)毒理學(xué)研究策略; 并根據(jù)頭孢菌素的案例研究，明確了頭孢菌素雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)的一般規(guī)則，可用于鑒定潛在的毒性雜質(zhì)，為藥物的安全性評(píng)價(jià)和雜質(zhì)限度控制提供基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞
頭孢菌素; 雜質(zhì); 斑馬魚; 毒性; ADMET; 分子對(duì)接
正文
藥物活性成分( active pharmaceutical ingredient，API) 在合成過程中，起始原料、中間體、試劑、反應(yīng)副產(chǎn)物等作為工藝雜質(zhì)不可避免地存在于終產(chǎn)品之中。
藥品的安全性不僅依賴于API 本身的毒理學(xué)性質(zhì)，且也與其所包含的雜質(zhì)毒理學(xué)性質(zhì)有關(guān)。
一些能誘發(fā)遺傳物質(zhì)突變、染色體斷裂和/或染色體重排的雜質(zhì)，稱之為遺傳毒性雜質(zhì)( genotoxic impurities，GIs) ，可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。
各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)藥品研發(fā)及生產(chǎn)過程中的雜質(zhì)控制和監(jiān)測(cè)越來越重視。除工藝雜質(zhì)外，藥物在合成、制劑生產(chǎn)和儲(chǔ)運(yùn)過程中也可產(chǎn)生降解雜質(zhì)。
β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床應(yīng)用最廣泛的一類抗生素，其主要包括青霉素和頭孢菌素。
頭孢菌素按其抗菌譜可分為5 代，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定它在合成和貯存中易產(chǎn)生各類降解雜質(zhì)，而不同頭孢菌素的結(jié)構(gòu)差異也導(dǎo)致該類藥品中的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)具有較大差異，并包括多種微量或痕量雜質(zhì)。
由于不同的雜質(zhì)可能具有不同的生物活性/毒性，對(duì)頭孢菌素毒性雜質(zhì)的識(shí)別和判定是其安全性評(píng)價(jià)和雜質(zhì)控制的難點(diǎn)。
目前ICH，F(xiàn)DA 以及國家藥品監(jiān)督管理局( NMPA) 對(duì)雜質(zhì)的鑒別、分類、限度控制均提出了研究和控制方案。
由于遺傳毒性雜質(zhì)具有更大的危害性，伴隨著2014 年ICH 遺傳毒性雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則［Assessment and Control of DNA Ｒeactive ( Mutagenic)Impurities in Pharmaceuticals to Limit PotentialCarcinogenic Ｒisk， ICH M7 ( Ｒ1) ］的頒布，其近年來已受到更廣泛的關(guān)注。
雖然遺傳毒性雜質(zhì)評(píng)估指導(dǎo)原則推薦使用雜質(zhì)純品，利用體外細(xì)菌致突變?cè)囼?yàn)對(duì)雜質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)估，但由于藥品中的雜質(zhì)多為微量或痕量，較難通過制備等方法獲得。
FDA和歐洲藥品管理局( European Medicines Agency，EMA) 等提出可利用基于定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系模型( quantitative structure-activity relationship，QSAＲ) ，通過計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)軟件評(píng)估藥物雜質(zhì)的遺傳毒性，即在對(duì)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，利用毒性預(yù)測(cè)軟件判斷雜質(zhì)是否具有警示結(jié)構(gòu)，進(jìn)而評(píng)估其是否具有遺傳毒性［1］。
近年來，我們借鑒FDA 和ICH 對(duì)雜質(zhì)毒性評(píng)估的策略與方法，針對(duì)頭孢菌素毒性雜質(zhì)識(shí)別和判定中的難點(diǎn)，初步建立了頭孢菌素雜質(zhì)毒性評(píng)估平臺(tái)。
此項(xiàng)研究工作不僅可為頭孢菌素的安全性評(píng)估提供技術(shù)依據(jù)，將臨床不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)與藥品質(zhì)量相關(guān)聯(lián)，且可以更合理地制定藥品標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)限度，進(jìn)而控制藥品質(zhì)量。
本文系統(tǒng)介紹頭孢菌素雜質(zhì)毒性評(píng)估平臺(tái)中所采用的雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)策略與方法。
內(nèi)容由凡默谷小編查閱文獻(xiàn)選取，排版與編輯為原創(chuàng)。如轉(zhuǎn)載，請(qǐng)尊重勞動(dòng)成果，注明來源于凡默谷公眾號(hào)。
1 雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)決策樹
對(duì)化學(xué)藥品中毒性雜質(zhì)的識(shí)別和判定是雜質(zhì)安全性評(píng)價(jià)和限度控制的難點(diǎn)。仿制藥品由于原料藥的合成路線、工藝以及制劑處方工藝與參比制劑可能不同，因此可能存在某些與參比制劑不同的雜質(zhì)。
對(duì)仿制藥中的雜質(zhì)研究和控制，國外要求參考參比制劑( 或原研藥) 的雜質(zhì)控制信息，通過雜質(zhì)的對(duì)比研究，制定仿制藥品中的雜質(zhì)限度。
根據(jù)化學(xué)藥品雜質(zhì)毒性的性質(zhì)，將雜質(zhì)分為3 類進(jìn)行控制: 遺傳毒性雜質(zhì)、普通毒性雜質(zhì)和普通雜質(zhì)。
遺傳毒性雜質(zhì)大多數(shù)具有強(qiáng)親電性，其可直接或間接損傷DNA 從而產(chǎn)生致突變作用，或者不與DNA 直接作用，通過間接機(jī)制產(chǎn)生致癌作用。
一般認(rèn)為，遺傳毒性雜質(zhì)和潛在致癌物比一般雜質(zhì)更具有危害性，特點(diǎn)是其在很低的濃度時(shí)即可造成對(duì)人體遺傳物質(zhì)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變并可能促使腫瘤發(fā)生。
普通毒性雜質(zhì)通過其他作用機(jī)理產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，例如某些皮膚致敏物，自身作為親電基團(tuán)與蛋白質(zhì)載體共價(jià)鍵形成半抗原蛋白復(fù)合體，從而形成特異性抗原。
目前ICH 對(duì)于遺傳毒性雜質(zhì)的鑒別、雜質(zhì)分類、限度控制及控制策略有較詳細(xì)的指導(dǎo)，但對(duì)于普通毒性雜質(zhì)的識(shí)別和判定、雜質(zhì)分類、限度控制方法及策略還沒有相應(yīng)的指導(dǎo)原則。
如何識(shí)別和判定普通毒性雜質(zhì)? 如何制定普通毒性雜質(zhì)限度控制策略? 普通毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法? 借鑒ICH 雜質(zhì)( 特別是遺傳毒性雜質(zhì)) 的鑒別、毒性評(píng)價(jià)策略，以及我們近年來積累的雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)，以雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系判斷不同雜質(zhì)毒性的性質(zhì)，進(jìn)而采用不同質(zhì)控策略，達(dá)到保證或提高此類藥品質(zhì)量的目的，降低其在臨床使用中的不良反應(yīng)發(fā)生率。
所建立的化學(xué)藥品雜質(zhì)毒性評(píng)估決策樹基本流程見圖1。
即: 對(duì)于已知結(jié)構(gòu)雜質(zhì)，首先判斷其是否具有“警示結(jié)構(gòu)”。如果具有“警示結(jié)構(gòu)”，則依據(jù)ICH 指南進(jìn)行遺傳毒性實(shí)驗(yàn)( Ames 實(shí)驗(yàn)) 。
若結(jié)果為陽性，即按遺傳毒性雜質(zhì)控制; 若是陰性，則進(jìn)一步判斷其是否具有其他特定毒性作用。
如果該雜質(zhì)不具有“警示結(jié)構(gòu)”，則利用計(jì)算機(jī)模擬與預(yù)測(cè)技術(shù)判斷其是否具有其他特定毒性作用。
若結(jié)果為陽性，則進(jìn)行斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)該特定毒性作用進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而確定是否將其按普通毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。
如果該雜質(zhì)不具有“警示結(jié)構(gòu)”，計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)也沒有發(fā)現(xiàn)其可能具有特定的毒性作用，則按普通雜質(zhì)控制。
目前，此項(xiàng)工作仍在探索研究中。
2 遺傳毒性雜質(zhì)評(píng)價(jià)策略及方法
ICH 頒布的ICH M7 ( Ｒ1) 為藥品中各類潛在的基因毒性雜質(zhì)的鑒別、分類、定性和控制提出了具體實(shí)施方案，是對(duì)ICH Q3A 和Q3B 的重要補(bǔ)充。
其建議首先進(jìn)行雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)的評(píng)估，然后利用數(shù)據(jù)庫和QSAＲ 模型進(jìn)行確認(rèn)，再開展細(xì)菌回復(fù)突變( Ames)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證的實(shí)施策略。
并推薦當(dāng)采用QSAＲ 模型進(jìn)行計(jì)算毒理學(xué)評(píng)估時(shí)，建議分別使用基于專家規(guī)則和統(tǒng)計(jì)學(xué)方式建立的2 個(gè)相互補(bǔ)充的QSAＲ 模型。
如果2 個(gè)互補(bǔ)的QSAＲ 模型均沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)警示，則可以認(rèn)為該雜質(zhì)沒有致突變的可能。
例如，利用OECD QSAＲ Toolbox 和Toxtree 計(jì)算機(jī)軟件對(duì)頭孢他啶及雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，預(yù)測(cè)結(jié)果提示，雜質(zhì)B 和D 可能具有遺傳毒性，而主要的警示結(jié)構(gòu)是3 位側(cè)鏈上的季胺基團(tuán)［2］。
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3 斑馬魚毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)
為了更有針對(duì)性地控制雜質(zhì)限度，提高質(zhì)檢水平，我們利用斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)( Fish EmbryoToxicity，F(xiàn)ET) 評(píng)價(jià)頭孢菌素及雜質(zhì)的毒性效應(yīng)。
見圖2。
斑馬魚體型纖細(xì)，成魚體長(zhǎng)3 ～4 cm，其世代周期短，3～4 個(gè)月就能達(dá)到性成熟。
斑馬魚常年產(chǎn)卵，卵易收集。卵在體外受精、發(fā)育，胚胎發(fā)育同步，且速度快。
在世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織( Organization forEconomic Co-operation and Development，OECD) 于2013 年發(fā)布的FET 檢測(cè)指導(dǎo)原則中，總結(jié)了其在藥物毒理學(xué)領(lǐng)域研究中的明顯優(yōu)勢(shì): 試驗(yàn)時(shí)間短( 3 ～5 d) ; 藥物用量小; 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量能達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 試驗(yàn)終點(diǎn)可量化; 處理操作方便; 對(duì)大量藥物可做出快速評(píng)估。
為評(píng)估頭孢菌素雜質(zhì)的毒性，建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特定毒性評(píng)價(jià)方法，并尋找頭孢菌素結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系，我們利用斑馬魚建立了藥物/雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)包括胚胎毒性、心臟毒性、神經(jīng)毒性等模型，用于藥物的急性毒性和靶器官毒性效應(yīng)的評(píng)價(jià)。
利用胚胎毒性中的致畸率、致死率表征藥物的急性毒性，不同的毒性表型說明藥物不同毒性功能基團(tuán)的反應(yīng)特性［3 － 5］; 對(duì)于神經(jīng)毒性，利用幼魚運(yùn)動(dòng)行為( 游動(dòng)距離、游動(dòng)速度、對(duì)光刺激的反應(yīng)) 的改變，表征藥物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用［3，6］; 對(duì)于心臟毒性，以幼魚心跳速率的改變結(jié)合對(duì)心臟發(fā)育畸形的觀測(cè)，或成魚心電圖的改變表征藥物對(duì)心臟功能的影響［7］。
在此基礎(chǔ)上總結(jié)頭孢菌素結(jié)構(gòu)與急性毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性的關(guān)系。
3.1 藥物毒性功能基團(tuán)
藥物分子中存在的和/或潛在的導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)毒性效應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)稱之為毒性功能基團(tuán)( toxic functional group) 。
潛在的毒性功能基團(tuán)可在生物體內(nèi)經(jīng)過代謝等途徑轉(zhuǎn)化，生成毒性功能基團(tuán)。
藥物分子中可能含有一個(gè)或多個(gè)毒性功能基團(tuán); 不同的毒性功能基團(tuán)在生物體內(nèi)產(chǎn)生的毒性效應(yīng)可能不同; 而對(duì)生物體的毒性效應(yīng)可能是多個(gè)毒性功能基團(tuán)共同作用的結(jié)果。
毒性功能基團(tuán)是研究藥物結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系的基礎(chǔ)。
我們通過對(duì)頭孢唑林鈉和頭孢西酮鈉雜質(zhì)的斑馬魚毒性評(píng)價(jià)研究，提出了頭孢菌素毒性功能基團(tuán)的概念［5］。
利用計(jì)算化學(xué)的方法，通過頭孢菌素3D 結(jié)構(gòu)-毒性功能基團(tuán)的關(guān)系研究，可以預(yù)測(cè)頭孢菌素的毒性功能基團(tuán)。對(duì)33 種頭孢菌素水溶液的最穩(wěn)定構(gòu)象的理論計(jì)算，可以將頭孢菌素的最穩(wěn)定構(gòu)象分為3 類，如圖3 所示。
① 整個(gè)分子呈較伸展的結(jié)構(gòu)，如頭孢唑林、頭孢羥氨芐等，其特點(diǎn)為3 位和7 位側(cè)鏈均充分暴露，藥物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)由3 位和7 位側(cè)鏈共同決定。
② 3 位或7 位側(cè)鏈具有較伸展的結(jié)構(gòu); 另一側(cè)鏈與分子中的其他基團(tuán)形成氫鍵等相互作用，呈現(xiàn)“折疊”結(jié)構(gòu)，如頭孢哌酮、頭孢曲松反式異構(gòu)體等。
處于伸展結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈更易與機(jī)體內(nèi)的受體發(fā)生相互作用，產(chǎn)生毒性效應(yīng)，即藥物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)主要由3 位或7 位側(cè)鏈中的毒性功能基團(tuán)決定。
如頭孢哌酮的3 位側(cè)鏈和7 位側(cè)鏈?zhǔn)遣煌亩拘怨δ芑鶊F(tuán); 頭孢哌酮的7 位側(cè)鏈具有較伸展的結(jié)構(gòu)，低濃度時(shí)就顯現(xiàn)7 位側(cè)鏈導(dǎo)致的毒性反應(yīng); 頭孢哌酮的3 位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)呈“折疊”結(jié)構(gòu)，在較高濃度時(shí)才顯現(xiàn)巰甲基四氮唑的毒性反應(yīng)［4］。
③ 整個(gè)分子呈折疊結(jié)構(gòu)，即3 位和7位側(cè)鏈均呈折疊狀態(tài)，如頭孢地嗪、頭孢替胺等，該類頭孢菌素的分子極性通常較低，易被生物體吸收［8］。
利用毒性功能基團(tuán)評(píng)估頭孢菌素( 如頭孢克洛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松及其異構(gòu)體等)的毒性效應(yīng)，總結(jié)出的頭孢菌素雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)規(guī)則如下。
規(guī)則1:
頭孢菌素的毒性反應(yīng)由其毒性功能基團(tuán)的結(jié)構(gòu)決定，結(jié)構(gòu)相近的頭孢菌素具有相似的毒性反應(yīng); 頭孢菌素3 位側(cè)鏈和7 位側(cè)鏈通常為不同的毒性功能基團(tuán)，它們可以獨(dú)立或協(xié)同發(fā)揮作用。
計(jì)算頭孢菌素的3D 結(jié)構(gòu)，可以預(yù)測(cè)其主要毒性作用。
規(guī)則2:
分子的毒性反應(yīng)不僅與毒性功能基團(tuán)的平面結(jié)構(gòu)有關(guān)，且與其3D 結(jié)構(gòu)有關(guān); 分子中具有2 個(gè)毒性功能基團(tuán)的頭孢菌素，具有伸展結(jié)構(gòu)的毒性功能基團(tuán)在低濃度下首先顯現(xiàn)其毒性效應(yīng)，即較易發(fā)揮作用。
規(guī)則3:
頭孢菌素降解可以形成新的毒性功能基團(tuán)，進(jìn)而產(chǎn)生與藥物分子不同的毒性反應(yīng)。
規(guī)則4:
藥物的毒性反應(yīng)由毒性功能基團(tuán)的特性與化合物的吸收特性共同決定; 用空間極性表面積( TPSA) 可表征藥物分子同分異構(gòu)體的吸收特性，通常TPSA 較小的異構(gòu)體更易被吸收。
規(guī)則5:
在已上市的頭孢菌素中，7位側(cè)鏈含氨噻肟結(jié)構(gòu)、3 位側(cè)鏈含巰甲基四氮唑結(jié)構(gòu)是較常見的2 類藥物，相對(duì)于其他側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，基于氨噻肟結(jié)構(gòu)和基于巰甲基四氮唑結(jié)構(gòu)形成的毒性功能基團(tuán)的急性毒性反應(yīng)通常較弱。
規(guī)則6:
頭孢菌素△異構(gòu)體之間，毒性功能基團(tuán)的空間結(jié)構(gòu)通常不發(fā)生較大改變，其對(duì)TPSA 的影響也相對(duì)較小，故△異構(gòu)體與藥物分子的毒性反應(yīng)相似。
規(guī)則7:
7 位側(cè)鏈為氨噻肟結(jié)構(gòu)的頭孢菌素的E-異構(gòu)體( 反式異構(gòu)體) ，由于7 位側(cè)鏈通常呈折疊狀，故更易顯現(xiàn)出3 位側(cè)鏈之毒性功能基團(tuán)的毒性反應(yīng)特性; 同時(shí)，折疊作用導(dǎo)致分子的TPSA 減弱，吸收作用增強(qiáng)，使得E-異構(gòu)體的毒性反應(yīng)相對(duì)更強(qiáng)。
規(guī)則8:
3 位側(cè)鏈為巰甲基四氮唑結(jié)構(gòu)的頭孢菌素，其3 位側(cè)鏈通常呈折疊狀，因此通常更易顯現(xiàn)出7 位毒性功能基團(tuán)的毒性反應(yīng)特性。
規(guī)則9:
3 位側(cè)鏈為簡(jiǎn)單取代基如甲基、丙烯基、氯等的頭孢菌素，3位取代基與7-ACA 母核結(jié)構(gòu)共同組成毒性功能基團(tuán)，發(fā)揮毒性效應(yīng)。
利用上述毒性評(píng)價(jià)規(guī)則，我們對(duì)國內(nèi)創(chuàng)新藥物頭孢嗪咪鈉及其雜質(zhì)的毒性作用進(jìn)行了預(yù)測(cè)［8］。
例如，頭孢嗪脒鈉的3D 結(jié)構(gòu)揭示其3 位的三嗪環(huán)呈外露狀態(tài)，是導(dǎo)致急性毒性反應(yīng)的主要毒性功能基團(tuán); 斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)揭示三嗪環(huán)的主要急性毒性效應(yīng)表現(xiàn)為致畸，因此頭孢嗪脒鈉的急性毒性作用主要以致畸反應(yīng)為主，其對(duì)斑馬魚表型的影響與頭孢曲松( 3 位側(cè)鏈的三嗪環(huán)) 誘導(dǎo)的致畸反應(yīng)相似。
頭孢嗪脒的TPSA 略大于頭孢硫脒，明顯小于頭孢曲松; 而分子的TPSA 與分子的被動(dòng)吸收呈負(fù)相關(guān)，提示其在斑馬魚體內(nèi)的濃度應(yīng)與頭孢硫脒相近。
因此，頭孢嗪脒鈉的毒性作用應(yīng)不大于頭孢硫脒和頭孢曲松鈉，實(shí)際測(cè)定結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果相同［8］。
內(nèi)容由凡默谷小編查閱文獻(xiàn)選取，排版與編輯為原創(chuàng)。如轉(zhuǎn)載，請(qǐng)尊重勞動(dòng)成果，注明來源于凡默谷公眾號(hào)。
3.2 藥物/雜質(zhì)體內(nèi)毒性效應(yīng)的預(yù)測(cè)
藥物在體內(nèi)的毒性作用除了與毒性功能基團(tuán)的結(jié)構(gòu)有關(guān)外，還與其在體內(nèi)的濃度有關(guān)。
在進(jìn)行斑馬魚毒性試驗(yàn)中，通常將藥物溶解于斑馬魚飼養(yǎng)液中，通過計(jì)算半數(shù)致死/致畸時(shí)的給藥濃度( LD50) 表征化合物的毒性效應(yīng)。
然而，LD50值是化合物的毒性和其吸收能力的綜合毒性效應(yīng)，此時(shí)斑馬魚體內(nèi)的藥物濃度反映毒性功能基團(tuán)的毒性效應(yīng)［3，9］。
為更準(zhǔn)確地利用斑馬魚毒性評(píng)價(jià)模型評(píng)價(jià)頭孢菌素毒性功能基團(tuán)的特性，我們利用LC-MS /MS 定量測(cè)定頭孢菌素在斑馬魚體內(nèi)的吸收情況［10］，并進(jìn)一步通過QSAＲ 方法，建立了斑馬魚體內(nèi)吸收與藥物結(jié)構(gòu)之間的定量關(guān)系模型，預(yù)測(cè)其他頭孢菌素及雜質(zhì)在斑馬魚體內(nèi)的吸收情況［11］，并構(gòu)建了頭孢菌素結(jié)構(gòu)-吸收-毒性評(píng)價(jià)系統(tǒng)。
不同結(jié)構(gòu)的頭孢菌素在斑馬魚體內(nèi)的吸收差異較大，結(jié)合吸收數(shù)據(jù)，更能準(zhǔn)確、有效地評(píng)價(jià)藥物在斑馬魚的胚胎毒性。
通過頭孢菌素結(jié)構(gòu)-吸收-毒性評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)頭孢唑林鈉的諸雜質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)研究發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)的體內(nèi)吸收能力明顯影響其毒性效應(yīng); 頭孢唑林鈉中雜質(zhì)G 的毒性效應(yīng)最強(qiáng)，雜質(zhì)A最易被機(jī)體吸收，而雜質(zhì)F 的綜合毒性效應(yīng)最強(qiáng)。
結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系分析表明，頭孢唑林鈉中的MMTD結(jié)構(gòu)是引起急性毒性反應(yīng)的毒性功能基團(tuán); 7-ACA結(jié)構(gòu)和MMTD 結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的毒性功能基團(tuán); MMTD 結(jié)構(gòu)和7-ACA 結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致心臟毒性的毒性功能基團(tuán)。
因此，頭孢唑林鈉中對(duì)含MMTD 結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)( 主要是雜質(zhì)F) 控制是關(guān)鍵［3］。
目前，我們也在利用藥物的斑馬魚LC50值，構(gòu)建頭孢菌素2D/3D QSAＲ 模型，預(yù)測(cè)雜質(zhì)的毒性。
為評(píng)估頭孢菌素雜質(zhì)在人體的ADMET 性質(zhì)，基于計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)軟件，通過比較雜質(zhì)與藥物ADMET參數(shù)的差異，可以預(yù)測(cè)雜質(zhì)與藥物分子的相對(duì)毒性。
我們以頭孢噻肟、頭孢他啶為例，通過比較藥物及雜質(zhì)的體內(nèi)ADMET 性質(zhì)，預(yù)測(cè)雜質(zhì)毒性的大?。?2］。
3.3 雜質(zhì)毒性作用機(jī)制的研究
在已建立的斑馬魚毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)中，我們將系統(tǒng)毒理學(xué)研究策略和技術(shù)應(yīng)用到對(duì)頭孢菌素雜質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)中，提出了頭孢菌素雜質(zhì)毒性作用機(jī)制的研究策略。
見圖4。
① 利用基因表達(dá)譜芯片和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)采集轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析方法，篩選頭孢菌素及其雜質(zhì)( 側(cè)鏈基團(tuán)) 的差異表達(dá)基因( DEGs)和差異共表達(dá)基因( CDEGs) 。
② 構(gòu)建藥物-基因、藥物-信號(hào)通路分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討特定的靶器官毒性，如神經(jīng)毒性、心臟毒性等及其分子作用機(jī)制。
③ 通過分子生物學(xué)技術(shù)，如qＲT-PCＲ、原位雜交、Western Blot 等技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)基因及其編碼蛋白的表達(dá)情況。
④ 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，尋找藥物毒性作用的可能靶分子及作用機(jī)制。
⑤ 利用同源建模和分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)和模擬雜質(zhì)與靶分子之間的相互作用，分析作用模式。
⑥ 尋找和確定效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志( biomarker of effect) ，用于雜質(zhì)毒性效應(yīng)的評(píng)價(jià)。
利用上述研究策略，對(duì)C-7位含有氨噻肟結(jié)構(gòu)的頭孢菌素結(jié)構(gòu)與神經(jīng)毒性的關(guān)系進(jìn)行了評(píng)價(jià): 頭孢菌素對(duì)斑馬魚神經(jīng)行為學(xué)的影響主要與母核7-ACA 結(jié)構(gòu)和C-3 位取代基有關(guān); 化合物可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的水平及感受器受體影響神經(jīng)行為學(xué); 頭孢菌素對(duì)gad2，or111-4，or126-3，grm1a，opn8c，or111-5，or113-2 和or118-3 基因表達(dá)的影響，可作為效應(yīng)生物標(biāo)志用于該類頭孢菌素神經(jīng)毒性的評(píng)價(jià)［6］。
對(duì)該類頭孢菌素結(jié)構(gòu)與心臟毒性的關(guān)系的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該類頭孢菌素的心臟毒性主要與母核7-ACA 結(jié)構(gòu)有關(guān); 頭孢菌素在胚胎發(fā)育階段可能通過影響心肌及血管的發(fā)育導(dǎo)致心臟毒性; 吸收、分布、代謝、排泄( ADME) 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，7-ACA 的C-3 側(cè)鏈發(fā)生改變后，將影響化合物在體內(nèi)的分布; 頭孢菌素對(duì)nppa，adra2c 和tnni1c 基因表達(dá)的影響，可能作為效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志用于該類頭孢菌素心臟毒性的評(píng)價(jià)［7］。
對(duì)C-3 位含有巰甲基四氮唑結(jié)構(gòu)的頭孢菌素( CNMTs) 結(jié)構(gòu)與胚胎毒性關(guān)系的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，CNMTs 誘導(dǎo)的斑馬魚急性毒性反應(yīng)具有濃度依賴性，在低濃度時(shí)，主要表現(xiàn)為出C-7取代基的毒性作用，在較高濃度下，C-3 取代基的毒性作用才顯現(xiàn);
CNMTs 中的巰甲基四氮唑( MTT) 結(jié)構(gòu)可影響has1 和cnnm2a 基因的表達(dá); 信號(hào)通路分析明顯指向其與影響神經(jīng)活性配體受體的相互作用有關(guān)，進(jìn)而影響心肌收縮和血管平滑肌收縮的功能［12］。
基于上述研究，我們對(duì)提出的頭孢菌素雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)規(guī)則進(jìn)行了完善。
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規(guī)則10:
導(dǎo)致頭孢菌素神經(jīng)毒性和心臟毒性的毒性功能基團(tuán)通常由7-ACA 母核結(jié)構(gòu)與3 位側(cè)鏈共同組成，3位側(cè)鏈為乙酰氧基結(jié)構(gòu)時(shí)，毒性效應(yīng)相對(duì)較強(qiáng); 7 位側(cè)鏈通過影響藥物的吸收而影響其毒性效應(yīng)。
規(guī)則11:
頭孢菌素可能通過與谷氨酸受體代謝型1a( glutamate receptor，metabotropic 1a，GＲM1A)蛋白和/或谷氨酸脫羧酶2 ( glutamate decarboxylase2，GAD2 ) 的相互作用產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，以GＲM1A 或GAD2 蛋白為受體與頭孢菌素進(jìn)行分子對(duì)接( docking) ，并與7-ACA 的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行比較，可以評(píng)估頭孢菌素的神經(jīng)毒性。
規(guī)則12:
頭孢菌素可能通過影響nppa， adra2c 和tnni1c 基因的表達(dá)，產(chǎn)生心臟毒性，以基因的編碼蛋白為受體與頭孢菌素進(jìn)行分子對(duì)接，并與7-ACA 的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行比較，可以評(píng)價(jià)頭孢菌素的心臟毒性。
規(guī)則13:
3 位側(cè)鏈為MTT 結(jié)構(gòu)的頭孢菌素可導(dǎo)致has1 和cnnm2a 基因表達(dá)的變化; 利用該類頭孢菌素與HAS1 蛋白的對(duì)接結(jié)果可以評(píng)估其急性毒性的強(qiáng)弱。
綜上，按照ICH 的基本原則，我們提出了評(píng)價(jià)頭孢菌素雜質(zhì)的基本策略，并依據(jù)研究結(jié)果，總結(jié)出頭孢菌素雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)的一般規(guī)則( 簡(jiǎn)稱規(guī)則，共13 條) 。
同時(shí)也建立了化學(xué)藥品雜質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)與預(yù)測(cè)平臺(tái)，用于探索藥物/雜質(zhì)的毒性作用機(jī)制并預(yù)測(cè)雜質(zhì)的毒性功能基團(tuán)。
這一研究成果為減少使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、縮短藥物評(píng)價(jià)周期、評(píng)估藥物雜質(zhì)的毒性作用、制定合理的雜質(zhì)限度，最終保證藥品的安全性與有效性具有重要意義。
該研究策略和技術(shù)方法將會(huì)在新藥研發(fā)和藥品一致性評(píng)價(jià)中發(fā)揮越來越重要的作用。
4 展望
4.1 如何將藥物/雜質(zhì)毒理學(xué)信息與藥物臨床不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)
2019 年3 月7 日，NMPA 發(fā)布了《關(guān)于修訂含頭孢哌酮藥品說明書的公告》。該公告要求不良反應(yīng)項(xiàng)下增加“血小板減少、低凝血酶原血癥、凝血障礙、出血”事項(xiàng)。
并警告出血的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素可能包括有臨床意義出血風(fēng)險(xiǎn)增加的損傷或病癥，例如近期發(fā)生過腦梗死( 缺血性或出血性) 、近期有出血的活動(dòng)性消化性潰瘍、自發(fā)性或獲得性止血平衡受損的患者、伴隨凝血障礙和有臨床相關(guān)出血風(fēng)險(xiǎn)的肝臟疾病; 系統(tǒng)性合并使用已知影響止血的藥物治療。
還通知頭孢哌酮藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)新增的不良反應(yīng)發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究。
截至目前，頭孢哌酮引起的出血不良反應(yīng)機(jī)制可能是: 3 位側(cè)鏈的N-甲巰四氮唑基團(tuán)( MTT) 干擾維生素K 或維生素B 的循環(huán)，通過阻礙凝血酶原的合成，導(dǎo)致較明顯的出血傾向發(fā)生。
但頭孢哌酮致出血的分子機(jī)制仍不十分明確，或一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與臨床觀察不能完全解釋上述的干擾機(jī)制。
研究結(jié)果初步揭示: 頭孢哌酮毒性與其3 位側(cè)鏈MTT 結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系［4］，以及頭孢哌酮可能通過MTT 結(jié)構(gòu)，抑制血管生成調(diào)節(jié)基因腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1b ( adcyap1b) 的表達(dá)［13］，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體的血管損傷。
目前，該研究仍在進(jìn)行中，我們期望將含MTT 結(jié)構(gòu)的藥物/雜質(zhì)的毒性效應(yīng)與臨床不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，更好地控制藥品質(zhì)量。
4.2 如何將不良反應(yīng)信息與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)聯(lián)
如何將雜質(zhì)毒性評(píng)價(jià)結(jié)果與不良反應(yīng)信息相關(guān)聯(lián)，與藥物在雜質(zhì)信息相關(guān)聯(lián)，是目前仿制藥一致性評(píng)價(jià)中亟待解決的問題，也是本研究的重點(diǎn)。
頭孢菌素中很多雜質(zhì)都屬于異構(gòu)體，在探討鹽酸頭孢替安的熱異構(gòu)化( thermo-isomerization) 過程中，發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)頭孢替安同分異構(gòu)體新雜質(zhì)，利用質(zhì)譜和一維及二維核磁共振技術(shù)確定了同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)，通過預(yù)測(cè)該雜質(zhì)分子在水溶液中穩(wěn)定構(gòu)象，推測(cè)其可能的毒性功能基團(tuán)，再利用分子對(duì)接技術(shù)比較藥物/雜質(zhì)與HAS1 靶蛋白的相互作用，結(jié)果表明它們均可能比頭孢替安的毒性效應(yīng)大［14］。
由于熱異構(gòu)化不僅可發(fā)生在頭孢替安中，在C-3 含有1-烷基-1H-四唑-5-硫醇側(cè)鏈的其他頭孢菌素中也會(huì)發(fā)生。
將不同產(chǎn)品中的該雜質(zhì)含量與不良反應(yīng)信息相關(guān)聯(lián)，則可以評(píng)估不同產(chǎn)品、工藝與特定不良反應(yīng)的關(guān)系。
這項(xiàng)研究對(duì)于頭孢菌素的雜質(zhì)評(píng)估具有重要意義。
來源：Internet
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