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腫瘤液體活檢的檢測靶標(biāo)主要包括循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)和外泌體等。盡管近年來ctDNA的研究取得了較大進(jìn)展，但其作為腫瘤標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中仍存在許多技術(shù)問題。本文簡單介紹了ctDNA的生物學(xué)特性及相關(guān)檢測面臨的挑戰(zhàn)，并概述了相關(guān)檢測試劑的審評思考。

一、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的生物學(xué)特性

生理或病理狀態(tài)下，細(xì)胞壞死或凋亡時細(xì)胞核內(nèi)或線粒體內(nèi)DNA會釋放到血液、胸腔積液、腦脊液、尿液和痰液等體液中。循環(huán)游離DNA(cfDNA)是細(xì)胞外DNA降解產(chǎn)物，片段大小約150～200 bp。人的cfDNA濃度多低于100μg/L，平均約30μg/L;中晚期腫瘤患者cfDNA濃度可高達(dá)1000μg/L，平均約180μg/L。

循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)作為cfDNA的一類，來源于腫瘤細(xì)胞，主要由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，可反映腫瘤的異質(zhì)性，目前關(guān)于ctDNA釋放的確切機(jī)制尚不明確。健康人中ctDNA的水平很低，腫瘤患者體內(nèi)可檢測到更高水平的ctDNA，且腫瘤患者體內(nèi)的ctDNA比例與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)。ctDNA在cfDNA中的占比較低，中晚期腫瘤患者ctDNA占cfDNA的比例約為8%～10%，在腫瘤早期或治療緩解后可低至0.01%～1.7%。血液中ctDNA半衰期為15 min至數(shù)小時。

ctDNA可反映患者體內(nèi)腫瘤的全景數(shù)據(jù)，全面反映與腫瘤組織相同的突變基因組信息，包含突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常以及甲基化等相關(guān)突變信息。

二、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的研究進(jìn)展

在ctDNA研究中，常用的檢測技術(shù)包括突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS)、數(shù)字PCR(dPCR)及新一代測序(NGS)等，各方法的檢測原理、靈敏度、特異性和通量各不相同。低豐度ctDNA對檢測技術(shù)的靈敏度要求很高。對于ARMS和dPCR，不同方法間的檢測差異與樣本處理、提取效率、引物位置和探針修飾等有關(guān)。對于NGS，其檢測靈敏度除與樣本處理有關(guān)外，還與每一步反應(yīng)效率和測序深度有關(guān)。

研究表明，通過檢測ctDNA，可獲得腫瘤的相關(guān)蹤跡信息，ctDNA在腫瘤篩查、早診診斷、微小殘留病灶和復(fù)發(fā)監(jiān)測、療效評價、指導(dǎo)靶向藥物使用及生存評估等各方面均具有一定的臨床應(yīng)用前景。

三、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測尚存在的問題

目前，ctDNA檢測仍面臨諸多問題。首先，針對不同種類及不同時期的腫瘤，尚無樣本采集、ctDNA提取以及擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)流程。其次，體液中ctDNA會被巨噬細(xì)胞實(shí)時清除，從而導(dǎo)致體液中ctDNA含量極低，但目前大多數(shù)ctDNA研究集中于具有相對高濃度ctDNA的晚期癌癥，缺乏早期癌癥和低濃度ctDNA的詳細(xì)經(jīng)驗(yàn)。

另外，ctDNA檢測會出現(xiàn)一定程度的假陰性和假陽性，主要原因是腫瘤的異質(zhì)性，原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤、ctDNA三者之間存在差異。而且，腫瘤組織和ctDNA檢測標(biāo)準(zhǔn)不一致，導(dǎo)致不同研究給出的一致性數(shù)據(jù)差異很大。此外，目前ctDNA尚處于小范圍研究，不同研究文獻(xiàn)得到的結(jié)果存在差異，需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)、詳細(xì)的數(shù)據(jù)分析，方可證明ctDNA作為腫瘤臨床生物標(biāo)志物的可靠性。

四、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測試劑批準(zhǔn)概況及審評思考

（一）境內(nèi)外循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測試劑批準(zhǔn)概況

目前，境內(nèi)外已批準(zhǔn)上市的循環(huán)腫瘤DNA檢測試劑主要分為兩大類：一類是檢測血漿等體液中特定基因的甲基化，用于特定腫瘤的輔助診斷或篩查。如：NMPA和美國FDA已相繼批準(zhǔn)了血漿SEPT9基因甲基化檢測試劑，用于特定人群結(jié)直腸癌的輔助診斷。NMPA目前批準(zhǔn)了肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A 基因甲基化檢測，用于肺癌的輔助診斷等。而且，已批準(zhǔn)的ctDNA甲基化檢測試劑，均基于熒光定量PCR方法，該方法的檢測靈敏度有限。

另一類是檢測血漿中特定基因的突變情況，用于特定藥物的伴隨診斷。如：美國FDA和NMPA相繼批準(zhǔn)了血漿中EGFR基因的突變檢測，用于奧希替尼等的伴隨診斷，上述方法均基于熒光定量PCR方法。此外，美國FDA于2020年批準(zhǔn)了Guardant Health的Guardant360 CDx血漿ctDNA檢測試劑，用于識別表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者，這些患者可能會受益于奧西替尼的治療。這是FDA 批準(zhǔn)的首個將NGS和液體活檢技術(shù)結(jié)合，指導(dǎo)臨床治療決策的診斷檢測。

（二）循環(huán)腫瘤DNA檢測試劑的審評思考

1.針對伴隨診斷用途，關(guān)注血漿循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測的適用性

研究表明，血漿ctDNA中基因突變檢測結(jié)果與腫瘤組織中的基因突變檢測結(jié)果存在較大差異，因此，腫瘤組織基因檢測依然是目前腫瘤靶向治療的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。NMPA批準(zhǔn)的吉非替尼說明書要求：晚期非小細(xì)胞患者治療前應(yīng)檢測組織EGFR突變，但腫瘤組織不可評估，則可檢測血液標(biāo)本中ctDNA并評估，以鑒別出最可能從吉非替尼治療中受益的NSCLC患者。2015年，《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》也提出當(dāng)腫瘤組織難以獲取時，可將血液EGFR基因突變檢測作為合適的替代，作為對可疑組織檢測結(jié)果的補(bǔ)充。NMPA批準(zhǔn)的ctDNA伴隨診斷試劑也強(qiáng)調(diào)了上述要求。

研究表明，針對不同癌種，血漿ctDNA腫瘤基因突變檢測與腫瘤組織基因突變檢測的一致性存在較大差異，對于那些檢測結(jié)果差異較大的癌種，應(yīng)綜合考慮臨床應(yīng)用風(fēng)險，慎重考慮血漿ctDNA檢測試劑作為伴隨診斷試劑的可行性，哪些腫瘤患者血漿ctDNA可作為組織基因檢測的替代需深入研究，不可盲目申報。

2.針對用于輔助診斷的DNA甲基化檢測試劑，關(guān)注循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測的臨床意義

應(yīng)關(guān)注特定甲基化基因的臨床使用價值。腫瘤基因甲基化研究是目前的熱點(diǎn)，針對不同癌種，往往出現(xiàn)多種不同的甲基化基因。在考慮某個甲基化基因是否具有臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值時，建議全面調(diào)研該甲基化基因的所有相關(guān)臨床研究資料，系統(tǒng)評價相關(guān)臨床研究設(shè)計是否科學(xué)、病例是否充分，得出的結(jié)論是否科學(xué)可信。在腫瘤發(fā)展早期，體液中的循環(huán)腫瘤DNA含量較低，甲基化檢測的靈敏度較低，可能導(dǎo)致無法滿足臨床使用需求。

五、小結(jié)

盡管研究表明ctDNA 檢測在腫瘤診療領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景，但仍存在諸多待研究的問題，包括樣本處理、檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和臨床適用性等。2018年，美國臨床腫瘤學(xué)會( ASCO) 和病理學(xué)家協(xié)會(CAP)發(fā)表聯(lián)合評估: 目前ctDNA 在腫瘤早期診斷、微小病變殘留檢測以及療效監(jiān)測的有效性和實(shí)用性證據(jù)依然不足，除了經(jīng)過法規(guī)審批的經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證的ctDNA檢測可用于指導(dǎo)靶向治療外，大多數(shù)ctDNA 檢測尚需大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床試驗(yàn)的支撐，現(xiàn)階段不宜在臨床廣泛開展，后續(xù)研究應(yīng)盡可能納入預(yù)期適用人群，通過嚴(yán)格設(shè)計的臨床研究來充分驗(yàn)證其臨床意義。

參考文獻(xiàn)：

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