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摘  要 / Abstract

 

筆者所在實(shí)驗(yàn)室多年從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作，提出了“深入研究，淺出標(biāo)準(zhǔn)”的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建理念。質(zhì)量導(dǎo)向的基礎(chǔ)研究、符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)體系構(gòu)建以及中藥質(zhì)量的精準(zhǔn)檢測(cè)是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建及其應(yīng)用的三個(gè)重要方面，本文總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)室圍繞以上三個(gè)方面開(kāi)展的研究工作思路、研究進(jìn)展和相關(guān)實(shí)踐。

 

The authors’ laboratory has been engaged in the research of quality standards for traditional Chinese medicine (TCM) for several decades,and proposed the general concept dubbed “comprehensive research and simplified standard” to establish the quality standards for TCM.Quality-oriented basic research,elaboration of quality standard system featuring TCM characteristics,and precise quality testing are the three important aspects in the development and application of TCM quality standards.This article summarizes our research ideas,progress and relevant practices in these respects.

 

關(guān) 鍵 詞 / Key words

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；復(fù)雜體系；定性鑒別；定量分析

 

quality standards; complex system; qualitative identification; qualitative assay

 

中藥質(zhì)量是中醫(yī)臨床療效的根本保證，也是中醫(yī)藥高質(zhì)量發(fā)展和走向國(guó)際的基石。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是保證中藥質(zhì)量的重要措施。理想的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該具有科學(xué)、合理、簡(jiǎn)便、實(shí)用等特點(diǎn)。鑒于此，筆者研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)20余年的實(shí)踐探索，基于“深入研究，淺出標(biāo)準(zhǔn)”的中藥質(zhì)量研究及標(biāo)準(zhǔn)制定指導(dǎo)思想開(kāi)展了系統(tǒng)的中藥質(zhì)量研究工作[1]。“深入研究”是指對(duì)中藥復(fù)雜體系的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)代謝過(guò)程以及藥效作用等開(kāi)展系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究，為制定科學(xué)合理的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供扎實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。“淺出標(biāo)準(zhǔn)”則是指要制定相對(duì)簡(jiǎn)便、科學(xué)可行的中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。并在以上基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法，建立質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)和檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)等支撐體系，滿足中藥質(zhì)量“精準(zhǔn)檢測(cè)”的需求。本文將總結(jié)團(tuán)隊(duì)在“深入研究”“淺出標(biāo)準(zhǔn)”“精準(zhǔn)檢測(cè)”三個(gè)方面的研究思路和相關(guān)代表性工作，期許為中藥質(zhì)量研究人員提供些許借鑒和參考。

 

01  “深入研究”-中藥復(fù)雜體系活性成份系統(tǒng)分析方法

 

針對(duì)中藥多成份復(fù)雜體系的特點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)綜合應(yīng)用中藥化學(xué)、分析化學(xué)、中藥藥理學(xué)及現(xiàn)代生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和方法，創(chuàng)新研究思路與技術(shù)方法，創(chuàng)新性地建立了貫穿“化學(xué)分析-體內(nèi)代謝-生物機(jī)制”的中藥系統(tǒng)分析方法學(xué)體系。通過(guò)“化學(xué)分析-體內(nèi)代謝-生物機(jī)制”的深入系統(tǒng)研究，建立了中藥復(fù)雜體系的系統(tǒng)分析方法和研究模式，實(shí)現(xiàn)了“深入研究”的目的，為現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了研究基礎(chǔ)。

 

1.1 中藥復(fù)雜體系活性成份分析的

 

新技術(shù)與新方法

 

1.1.1 開(kāi)展中藥指紋圖譜研究，并將液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)技術(shù)應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系的系統(tǒng)分析

 

本實(shí)驗(yàn)室建立了一套中藥分析的方法學(xué)體系，解決了中藥化學(xué)成份特別是微量成份難以分析和鑒定的技術(shù)難題。采用LC/MS技術(shù)系統(tǒng)地研究了中藥主要類(lèi)別化學(xué)成份的電噴霧離子源(ESI)及大氣壓化學(xué)電離源(APCI)多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律，并將這些規(guī)律應(yīng)用于中藥未知成份及微量成份的快速分析和結(jié)構(gòu)鑒定。該技術(shù)改變了以往只有通過(guò)繁瑣的化學(xué)分離才能鑒定中藥成份的狀況，可在1小時(shí)之內(nèi)鑒定數(shù)十個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，極大程度上縮短了中藥化學(xué)研究的周期。將LC/MS與指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合，可以盡可能多地指認(rèn)中藥高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜中的色譜峰，從而進(jìn)一步加強(qiáng)指紋圖譜與中藥生物效應(yīng)的關(guān)聯(lián)，提高指紋圖譜的研究?jī)r(jià)值。從丹參、靈芝、大黃、降香、連翹、麥冬等10多種中藥及其成品制劑中分析鑒定了500多個(gè)化合物，其中很多成份為首次報(bào)道。例如：實(shí)驗(yàn)室在丹參的研究中[2]，建立了用于分析丹參酚酸類(lèi)成份的HPLC-DAD-ESI-MSn方法，并將該方法用于分析經(jīng)過(guò)固相萃取(SPE)處理的丹參提取物，檢測(cè)并鑒定了42個(gè)成份，其中有16個(gè)是新化合物。為快速鑒定中藥、生物樣品等復(fù)雜體系中的酚酸類(lèi)成份奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)研究了11個(gè)丹參酮類(lèi)化合物的ESI-MSn多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑，總結(jié)了該類(lèi)化合物的裂解規(guī)律，并將此規(guī)律應(yīng)用于丹參藥材中丹參酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，從氯仿-甲醇(3∶7)提取物中鑒定了27個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，其中5個(gè)為新化合物。目前，通過(guò)增加額外的分離維度(二維液相串聯(lián)質(zhì)譜)、智能觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴性采集及數(shù)據(jù)后處理等方法的綜合運(yùn)用，可以實(shí)現(xiàn)單一中藥中近千個(gè)化合物的鑒定[3-4]。

 

此外，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用 LC/MS 技術(shù)解決了中藥品種的多來(lái)源問(wèn)題。中藥品種的多來(lái)源問(wèn)題普遍存在，多種植物品種可能作為同一種中藥在臨床使用。長(zhǎng)期以來(lái)，由于缺乏有力的技術(shù)手段，往往難以區(qū)分不同的中藥材品種，導(dǎo)致不同品種同等使用。采用LC/MS 技術(shù)對(duì)菟絲子、靈芝、鉤藤[5]等中藥的不同品種進(jìn)行了全面的對(duì)照分析，首次發(fā)現(xiàn)不同“正品”藥材的主要有效成份存在顯著差異，預(yù)示其治療作用將有明顯不同。本研究為澄清中藥的品種問(wèn)題提供了新的思路和方法。例如從中藥菟絲子的甲醇提取物中鑒定了50個(gè)化合物，包括23個(gè)黃酮類(lèi)、20個(gè)木脂素和7個(gè)奎尼酸類(lèi)化合物[6]；發(fā)現(xiàn)市售的菟絲子藥材實(shí)際上來(lái)源于南方菟絲子，其化學(xué)成份與中國(guó)菟絲子存在明顯差異。根據(jù)該研究結(jié)果，建議對(duì)兩種菟絲子分別進(jìn)行藥效學(xué)研究，以澄清菟絲子藥材的品種問(wèn)題。

 

1.1.2 提出了化學(xué)指紋圖譜分析結(jié)合多指標(biāo)成份定量的中藥質(zhì)量控制模式

 

本實(shí)驗(yàn)室提出并實(shí)踐了化學(xué)指紋圖譜分析結(jié)合多成份定量的中藥質(zhì)量控制新模式，既符合中藥的整體用藥特色又滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)藥品質(zhì)量的要求。此研究模式不同于以往僅對(duì)中藥的少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)成份作定性定量分析的質(zhì)控思路，而是先建立中藥的化學(xué)指紋圖譜，再利用LC/MS等先進(jìn)的分析技術(shù)對(duì)指紋峰作全面分析與指認(rèn)，結(jié)合指認(rèn)成份的體內(nèi)代謝以及生物學(xué)活性選擇多個(gè)指標(biāo)性成份或有效成份，建立同時(shí)測(cè)定多個(gè)成份的定量分析方法。

 

將定性與定量方法相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的全面控制。建立了丹參藥材及相關(guān)制劑的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)指紋圖譜，利用與對(duì)照品比對(duì)以及LC/MS 技術(shù)，指認(rèn)了丹參指紋圖譜中的17個(gè)酚酸類(lèi)成份和17個(gè)丹參酮類(lèi)成份。采用HPLC/DAD方法對(duì)多種指標(biāo)性成份同時(shí)進(jìn)行定量分析[7]，包括丹參中6個(gè)主要的酚酸類(lèi)成份(丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A及丹酚酸B)和4個(gè)主要的丹參酮類(lèi)成份(二氫丹參酮 I、隱丹參酮、丹參酮 I及丹參酮IIA)，此兩類(lèi)化合物是丹參發(fā)揮活血化瘀作用的主要有效成份，因此各成份的含量對(duì)于丹參的質(zhì)量控制具有重要意義。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了臨床常用中藥制劑丹參注射液及香丹注射液的指紋圖譜，提出了明確的產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，比以往只監(jiān)測(cè)丹參酮IIA等個(gè)別化合物含量的舊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有了明顯的提高，更能反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量，并確保臨床用藥的安全性。新制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已在全國(guó)多家生產(chǎn)企業(yè)得到廣泛應(yīng)用。

 

本實(shí)驗(yàn)室建立了三七藥材的HPLC指紋圖譜以檢測(cè)其中的三萜皂苷等主要有效成份，同時(shí)對(duì)其中的6個(gè)主要人參皂苷類(lèi)成份(人參皂苷Rg1，Rb1，Rg2，Rh1，Rd及三七皂苷R1)進(jìn)行定量分析[8]。通過(guò)數(shù)學(xué)模型，利用相對(duì)保留值、重疊率、差異率以及特征指紋峰等參數(shù)將直觀的色譜指紋圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜，從而更能客觀地評(píng)價(jià)三七藥材的質(zhì)量。該方法還延伸至五加科人參屬的其他幾種名貴中藥材，獲得不同藥材的HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)了不同生長(zhǎng)地區(qū)及不同炮制方法得到的人參(如老山參、園參、紅參、生曬參等)、西洋參、三七及其偽品等的主要鑒別特征，對(duì)于此類(lèi)名貴藥材的快速準(zhǔn)確鑒別具有重要價(jià)值。

 

1.1.3 深入研究一個(gè)對(duì)照品測(cè)定多個(gè)成份含量的“一標(biāo)多測(cè)”方法

 

對(duì)照品獲得困難是多指標(biāo)成份定量分析方法應(yīng)用的瓶頸。一標(biāo)多測(cè)法是指在含量測(cè)定時(shí)，采用一個(gè)對(duì)照品，同時(shí)對(duì)多個(gè)成份進(jìn)行含量測(cè)定，解決了對(duì)照品缺乏的問(wèn)題；其他成份通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間及對(duì)照藥材(或?qū)φ仗崛∥?的特征圖譜確認(rèn)色譜峰，進(jìn)而根據(jù)相對(duì)轉(zhuǎn)換因子計(jì)算其他色譜峰的含量。在標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行階段及方法構(gòu)建階段時(shí)，一標(biāo)多測(cè)法與傳統(tǒng)的多指標(biāo)成份定量評(píng)價(jià)方法相比較，多進(jìn)行了相對(duì)轉(zhuǎn)換因子和相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算，對(duì)方法的耐用性要求更高，而后者需要更多的對(duì)照品。一標(biāo)多測(cè)法構(gòu)建的內(nèi)容包括：指標(biāo)成份的確立、分析方法的建立、相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算、方法學(xué)驗(yàn)證及多個(gè)實(shí)驗(yàn)室復(fù)核；其中相對(duì)校正因子是一標(biāo)多測(cè)方法的核心，如何保證方法建立中所獲得的校正因子具有可重復(fù)性是該分析方法的重點(diǎn)。在研究工作中重點(diǎn)對(duì)校正因子的多方面影響因素進(jìn)行了考察，采用丹參酮類(lèi)成份對(duì)一標(biāo)多測(cè)方法的建立進(jìn)行了系統(tǒng)性研究[9]，包括對(duì)影響校正因子的環(huán)境因素、操作參數(shù)及儀器系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行了科學(xué)的設(shè)計(jì)和分析，通過(guò)對(duì)主要影響參數(shù)的詳細(xì)描述及控制從而保證該方法的廣泛應(yīng)用，使其在不同的實(shí)驗(yàn)室使用具有較好的重現(xiàn)性，該部分工作是《美國(guó)藥典》丹參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的重要組成部分[10]。

 

1.2 中藥復(fù)雜體系體內(nèi)代謝分析的

 

新方法與新模型

 

1.2.1 系統(tǒng)開(kāi)展中藥復(fù)雜體系的體內(nèi)代謝及藥代動(dòng)力學(xué)分析研究

 

本實(shí)驗(yàn)室闡明了中藥成份的代謝途徑及藥代動(dòng)力學(xué)行為，對(duì)于揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及建立科學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。由于中藥化學(xué)組成的復(fù)雜性，其體內(nèi)代謝及藥動(dòng)學(xué)研究一直是該領(lǐng)域內(nèi)難點(diǎn)。建立了代謝指紋圖譜分析方法，對(duì)丹參(酚酸及二萜酮)、三七、降香、鉤藤、蟾酥等常用中藥以及冠心II號(hào)、丹七通脈片等相關(guān)中藥復(fù)方進(jìn)行了較系統(tǒng)的體內(nèi)過(guò)程和代謝動(dòng)力學(xué)研究[11-13]，采用SPE、HPLC及LC/MS 等技術(shù)考察了這些復(fù)方以及單味藥的有效成份在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程，并對(duì)部分有效化合物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

 

本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)地研究了丹參酚酸類(lèi)成份在大鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程[14]。經(jīng)注射給藥，除原兒茶醛外，丹參總酚酸中的其他成份均出現(xiàn)在大鼠血漿中，但各成份的相對(duì)含量發(fā)生了變化。建立液液萃取與固相萃取相結(jié)合的生物樣品處理方法，結(jié)合LC/MS 分析技術(shù)，確定了大鼠口服和尾靜脈注射丹參總酚酸后體液中的5個(gè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，推測(cè)了丹參總酚酸在大鼠體內(nèi)的代謝及排泄途徑。并研究了丹酚酸B在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明丹酚酸B在大鼠體內(nèi)的吸收消除符合二室模型，屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。該研究基本闡明了丹參進(jìn)入體內(nèi)的酚酸類(lèi)化學(xué)成份，這些成份很可能是丹參發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)；對(duì)于闡明中藥及其復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、揭示中藥治病的化學(xué)機(jī)制具有重要意義，同時(shí)為建立中藥整體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)。

 

1.2.2 提出并建立了生物轉(zhuǎn)化作為中藥體內(nèi)代謝研究的體外研究模型

 

本實(shí)驗(yàn)室提出并建立了生物轉(zhuǎn)化作為中藥體內(nèi)代謝研究的體外研究模型，輔助預(yù)測(cè)、鑒定并制備體內(nèi)代謝產(chǎn)物；并通過(guò)研究實(shí)踐證明了該研究模型的可行性，為中藥的體內(nèi)代謝研究增加了新的研究手段。生物轉(zhuǎn)化是對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的中藥活性成份進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的重要手段。本研究建立了微生物轉(zhuǎn)化和植物培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，對(duì)具有顯著生物活性及應(yīng)用前景但活性不夠理想或具有毒性的中藥有效成份進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了活性增強(qiáng)的先導(dǎo)化合物。尤其值得注意的是，中藥復(fù)雜體系的體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定一直是中藥體內(nèi)研究的難點(diǎn)，而生物轉(zhuǎn)化技術(shù)則可以作為藥物代謝的體外模型，輔助推測(cè)微量代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)并提供重要的對(duì)照品。完成了蟾蜍甾烯、人參皂苷、紫杉烷、雷公藤二萜、青蒿素、吳茱萸生物堿等多類(lèi)活性天然產(chǎn)物的微生物轉(zhuǎn)化及植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究，共獲得129個(gè)產(chǎn)物，其中85個(gè)是新化合物。多個(gè)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)與其體內(nèi)代謝反應(yīng)具有高度相似性。生物轉(zhuǎn)化技術(shù)為中藥的體內(nèi)代謝研究提供了新的思路和手段。蟾蜍甾烯是中藥蟾酥的主要有效成份，其中以華蟾毒精、脂蟾毒配基和蟾毒靈的含量最高。近年發(fā)現(xiàn)此類(lèi)化合物具有顯著的抗腫瘤活性，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。為了尋找具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的新穎先導(dǎo)化合物，對(duì)以上3個(gè)化合物分別進(jìn)行了系統(tǒng)性生物轉(zhuǎn)化研究，得到78個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中52個(gè)為新化合物。從鏈格孢Alternaria alternata AS 3.4578對(duì)華蟾毒精的生物轉(zhuǎn)化中，分離并鑒定了6個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中5個(gè)為新化合物[15]：主要轉(zhuǎn)化反應(yīng)為12β-羥基化反應(yīng)，3-OH脫氫反應(yīng)，以及16-位脫乙?；磻?yīng)；該轉(zhuǎn)化反應(yīng)的動(dòng)態(tài)考察結(jié)果表明，底物華蟾毒精在加入微生物培養(yǎng)體系24小時(shí)之后即全部選擇性地轉(zhuǎn)化為12β-羥基-華蟾毒精，該產(chǎn)物隨后依次發(fā)生3-OH脫氫反應(yīng)和16-位脫乙?；磻?yīng)，生成相應(yīng)的次級(jí)產(chǎn)物。依據(jù)此結(jié)果可初步推導(dǎo)出Alternaria alternata對(duì)華蟾毒精的生物轉(zhuǎn)化途徑。經(jīng)對(duì)以上蟾蜍甾烯的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性測(cè)試，總結(jié)了此類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)于蟾蜍甾烯的進(jìn)一步研究具有重要啟示意義。

 

1.3 中藥復(fù)雜體系作用的生物學(xué)機(jī)制研究

 

中藥復(fù)雜體系的作用機(jī)制研究中迫切需要應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展的新技術(shù)和新手段，探索適合中藥研究的新方法和新模式，揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室建立了以蛋白質(zhì)組為主的系統(tǒng)生物學(xué)方法運(yùn)用于中藥生物學(xué)作用研究的新模式，系統(tǒng)地研究了包括靈芝、丹參、三七、蟾酥、藤黃在內(nèi)的多種中藥的生物學(xué)作用及其作用靶點(diǎn)。研究結(jié)果證實(shí)了中藥生物學(xué)作用的研究新模式-系統(tǒng)生物學(xué)分析的可行性和有效性。同時(shí)，在中藥的系統(tǒng)生物學(xué)分析中，我們發(fā)現(xiàn)不同中藥作用后導(dǎo)致的生物體(細(xì)胞或組織)蛋白質(zhì)表達(dá)譜或基因表達(dá)譜的改變具有特征性，提示可能可以作為生物指紋圖譜用于中藥的生物學(xué)鑒定和質(zhì)量分析。

 

中藥?kù)`芝中主要含有靈芝三萜類(lèi)和靈芝多糖兩類(lèi)成份，對(duì)這兩類(lèi)成份我們進(jìn)行了分別的研究。對(duì)靈芝三萜類(lèi)成份的研究中通過(guò)考察比較包括靈芝酸D、靈芝酸F、靈芝酸K、靈芝酸B、靈芝酸AM1以及含有總?cè)频奶崛∥锏捏w外細(xì)胞毒性作用以及對(duì)腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，尋找到該類(lèi)成份的特征蛋白靶點(diǎn)如翻譯起始因子、14-3-3蛋白、過(guò)氧化還原酶等，并繪制出作用的網(wǎng)絡(luò)[16]。對(duì)靈芝多糖類(lèi)成份的研究則考察了該類(lèi)成份對(duì)免疫細(xì)胞的促增殖作用、對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響以及對(duì)于化療藥物所致免疫抑制作用的改善，并發(fā)現(xiàn)了與該類(lèi)成份的免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)[17]。這些研究結(jié)果綜合闡明了靈芝在傳統(tǒng)應(yīng)用中常用于抗腫瘤的可能機(jī)制，靈芝中的三萜和多糖兩類(lèi)成份在靈芝的抗腫瘤作用中分別承擔(dān)了殺滅腫瘤細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。研究中還發(fā)現(xiàn)不同中藥的生物作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)圖譜具有一定的特征性：例如藤黃中的藤黃酸類(lèi)成份也具有細(xì)胞毒性作用，但是其生物作用的靶點(diǎn)圖譜與靈芝中的靈芝酸類(lèi)成份的圖譜具有明顯的差異。根據(jù)生物指紋圖譜的特征可以從生物作用靶點(diǎn)方面對(duì)中藥進(jìn)行鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)，為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新的技術(shù)方法。

 

02、“淺出標(biāo)準(zhǔn)”-國(guó)際化導(dǎo)向的中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系創(chuàng)建與應(yīng)用

 

遵循科學(xué)性、整體性和實(shí)用性的原則，團(tuán)隊(duì)綜合應(yīng)用中藥化學(xué)、中藥分析、化學(xué)計(jì)量學(xué)等多學(xué)科的新技術(shù)和新方法，圍繞創(chuàng)建“中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系”的目標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)技術(shù)與方法的創(chuàng)新性研究，創(chuàng)新性地構(gòu)建了符合中藥復(fù)雜體系特點(diǎn)以及廣泛適用的中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，主要包括三個(gè)方面：一是用于判別真?zhèn)蔚恼w鑒別，包括對(duì)照物質(zhì)制備技術(shù)、對(duì)照?qǐng)D譜整體鑒別方法；二是用于評(píng)價(jià)優(yōu)劣的系統(tǒng)定量分析，包括全成份化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)建立的方法、待測(cè)成份的確定方法、多成份含量測(cè)定方法及與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的結(jié)果分析方法；三是在此基礎(chǔ)上形成系列指導(dǎo)原則并應(yīng)用到國(guó)際主流藥典中藥標(biāo)準(zhǔn)的起草工作中。“淺出標(biāo)準(zhǔn)”有力地推動(dòng)了中藥標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際化與中藥產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展。

 

2.1 判別真?zhèn)蔚恼w鑒別

 

2.1.1 對(duì)照提取物

 

在實(shí)驗(yàn)研究中，經(jīng)常會(huì)遇到用于定性的對(duì)照品或?qū)φ账幉娜必浕蛘哔I(mǎi)到的對(duì)照藥材不同批號(hào)間差異較大的問(wèn)題。團(tuán)隊(duì)在大量實(shí)踐工作中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照提取物的制備比對(duì)照化合物更易獲得，經(jīng)濟(jì)實(shí)用；同時(shí)又比用對(duì)照藥材制定的標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)謹(jǐn)，易保證良好的批間一致性，在相同的色譜條件下，色譜行為重現(xiàn)性好。對(duì)照提取物用于整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的創(chuàng)建。在定性研究中，采用對(duì)照提取物進(jìn)行薄層鑒別中條帶(或斑點(diǎn))以及特征圖譜中特征峰的指認(rèn)。在定量研究中，采用對(duì)照提取物在多指標(biāo)成份測(cè)定時(shí)用于非對(duì)照色譜峰的指認(rèn)。團(tuán)隊(duì)完成了三七、五味子、鉤藤等對(duì)照提取物的制備及標(biāo)定，并應(yīng)用于相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的制定中。

 

2.1.2 對(duì)照?qǐng)D譜

 

中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的構(gòu)建離不開(kāi)整體鑒別，采用對(duì)照?qǐng)D譜(包括薄層圖譜與特征圖譜)對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行表征和甄別，具有直觀、簡(jiǎn)單、清晰的優(yōu)點(diǎn)。

 

本實(shí)驗(yàn)室建立了高效薄層色譜鑒定方法的國(guó)際通則，實(shí)現(xiàn)薄層圖譜在全球其他實(shí)驗(yàn)室能夠完全重現(xiàn)。目前的薄層鑒別主要存在兩個(gè)問(wèn)題：一是因?yàn)檠芯坎灰?guī)范，難以重現(xiàn)；二是僅鑒別主要斑點(diǎn)，未能顯示中藥的多成份特征。團(tuán)隊(duì)建立了規(guī)范化的高效薄層圖譜獲取技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，包括薄層板預(yù)處理、點(diǎn)樣方式、預(yù)飽和時(shí)間、展開(kāi)距離、顯色方式、溫度與濕度、數(shù)碼記錄方式、圖譜編輯標(biāo)準(zhǔn)等，得到的薄層圖譜能夠在全球其他實(shí)驗(yàn)室重現(xiàn)，確保了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性；同時(shí)最大程度地把中藥中的主要成份快速直觀地表征出來(lái)，增加了薄層圖譜整體鑒別能力。按照所制定的國(guó)際通則已經(jīng)建立了歐美藥典中三七、紅參、五味子、薏苡仁、鉤藤等二十余個(gè)薄層鑒別方法：鉤藤薄層鑒別方法，可同時(shí)檢識(shí)出11個(gè)吲哚類(lèi)生物堿成份，用于完成多來(lái)源鉤藤藥材(包括鉤藤，大葉鉤藤，白鉤藤，毛鉤藤，華鉤藤等)品種鑒別，起到鑒別藥材真?zhèn)蔚淖饔肹18]。

 

本實(shí)驗(yàn)室率先采用對(duì)照藥材或?qū)φ仗崛∥锝?duì)照特征圖譜，對(duì)特征成份進(jìn)行色譜峰定位，確立多品種之間的差異成份用于品種鑒定。如，紅參的特征圖譜為包括人參皂苷Rg1,Re,Rf,Rb1,Ro,Rc,Rb2,Rd 八個(gè)特征性成份；三七特征圖譜中為包括三七皂苷R1、人參皂苷Rg1,Re,Rb1,Rd五個(gè)特征性成份。這些成份的特征圖譜還可以協(xié)助多指標(biāo)成份含量測(cè)定中確定各待測(cè)色譜峰，以保證使用正確的校正因子進(jìn)行計(jì)算。

 

2.2 評(píng)價(jià)優(yōu)劣的系統(tǒng)定量分析

 

2.2.1 全成份化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

 

中藥化學(xué)成份復(fù)雜，建立全成份化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)揭示其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，是制定科學(xué)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的前提。率先采用離線全二維液相色譜-高分辨質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)實(shí)現(xiàn)中藥全面的化學(xué)成份分析與表征。通過(guò)基于親水相互作用色譜-反相色譜與四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜相結(jié)合的離線二維液質(zhì)分析方法，與自建“全息成份庫(kù)”相結(jié)合的分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)中藥成份分析的高效、智能化，并應(yīng)用到三七、紅參、鉤藤等研究中[3-4]。例如，鉤藤全成份化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)205個(gè)成份，主要包含生物堿類(lèi)128個(gè)，三萜酸類(lèi)63個(gè)和黃酮等其他類(lèi)別化合物14個(gè)；該研究結(jié)果為《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定多成份的確定提供了可靠的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)支持。

 

2.2.2 待測(cè)成份的確定

 

待測(cè)成份的正確選擇是系統(tǒng)定量分析方法的關(guān)鍵。特征圖譜在待測(cè)成份確定方面起著重要作用：揭示同一品種多個(gè)產(chǎn)地、不同批次藥材之間的共性；反映同一品種不同來(lái)源的藥材之間的異同；揭示易混淆品種之間的差異；直觀反映炮制品在炮制前后的區(qū)別。建立的紅參特征圖譜，共考察了21批藥材，對(duì)所有批次呈現(xiàn)出的共有峰進(jìn)行了總結(jié)，作為含測(cè)指標(biāo)的備選成份；同時(shí)獲得了人參、西洋參兩個(gè)易混淆品種的特征圖譜，對(duì)人參在蒸制前后的各色譜峰進(jìn)行了逐一比對(duì)，并通過(guò)模擬紅參的炮制過(guò)程對(duì)蒸制前后比對(duì)結(jié)果加以佐證。最后，對(duì)上述特征圖譜各方面的信息進(jìn)行綜合考慮，選擇了人參皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Ro，Rc，Rb2及Rd這八個(gè)特征成份，既能反映紅參的整體質(zhì)量，又能用于區(qū)分混淆品，作為紅參在《美國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定中的指標(biāo)。

 

2.2.3 多成份的含量測(cè)定

 

多成份含量測(cè)定是中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分。超高效液相色譜技術(shù)應(yīng)用被率先引入到《美國(guó)藥典》Herbal Medicine Compendium標(biāo)準(zhǔn)中，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)成份的良好分離。

 

《美國(guó)藥典》要求測(cè)定盡可能多的成份，而多指標(biāo)成份含量測(cè)定的前提是實(shí)現(xiàn)各指標(biāo)成份的良好分離。超高效液相色譜技術(shù)(UHPLC)以其更大的峰容量、更好的分離度、更快的分析速度、更高的靈敏度，為中藥整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中多指標(biāo)含量測(cè)定研究帶來(lái)了更好的解決方法。采用UHPLC方法可在5分鐘完成三七的5個(gè)指標(biāo)成份的含量測(cè)定，高效、快速，成功地縮減了標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行的時(shí)間成本。對(duì)UHPLC方法進(jìn)行與之對(duì)應(yīng)的高效液相色譜方法轉(zhuǎn)化，作為輔助也可以提升標(biāo)準(zhǔn)選擇的靈活性。UHPLC技術(shù)在大幅提升峰容量及分析效率的同時(shí)，使不同色譜柱、不同儀器上相對(duì)保留時(shí)間的變化問(wèn)題變得更為突出。

 

由于UHPLC的高容量特征，保留時(shí)間變化后，很可能影響目標(biāo)成份的分離，或者影響樣品圖譜與對(duì)照提取物標(biāo)準(zhǔn)圖譜的比對(duì)。因此，在UPHLC標(biāo)準(zhǔn)方法建立的過(guò)程中，必須首先獲得相對(duì)穩(wěn)定的保留時(shí)間。如，在五味子《美國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，對(duì)UHPLC色譜條件進(jìn)行了多種嘗試和驗(yàn)證，最終確定了簡(jiǎn)單實(shí)用的流動(dòng)相系統(tǒng)，保證了4個(gè)木脂素類(lèi)成份保留時(shí)間的相對(duì)穩(wěn)定；《美國(guó)藥典》在三七標(biāo)準(zhǔn)的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，針對(duì)目標(biāo)成份設(shè)立了適當(dāng)?shù)奶荻认疵摮绦?，?shí)現(xiàn)了不同色譜柱及儀器上的正常應(yīng)用。自此，UHPLC技術(shù)成功應(yīng)用到了中藥的整體質(zhì)量控制當(dāng)中，《美國(guó)藥典》Herbal Medicine Compendium也開(kāi)始陸續(xù)收錄 UHPLC含量測(cè)定方法。

 

2.2.4 與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的分析

 

在整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系模式構(gòu)建中，因?yàn)樘卣鲌D譜及多成份含量測(cè)定等方法的應(yīng)用，使得質(zhì)量控制已由傳統(tǒng)的少數(shù)成份轉(zhuǎn)化為多成份分析。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中多變量統(tǒng)計(jì)分析可以進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)差異直觀地顯示出來(lái)。如采用 UHPLC與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)三七不同部位、不同等級(jí)樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，獲得了83批樣品的分布情況及相關(guān)性，確認(rèn)《美國(guó)藥典》三七標(biāo)準(zhǔn)中5個(gè)含量測(cè)定指標(biāo)成份的選擇，以上方法既體現(xiàn)了樣品的共性，也可通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析呈現(xiàn)出差異性，使得數(shù)據(jù)分析及結(jié)果更加科學(xué)有價(jià)值。

 

2.3 整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的綜合應(yīng)用研究

 

在整體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系方法構(gòu)建后，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步推動(dòng)將其應(yīng)用于《中國(guó)藥典》與國(guó)際主流藥典標(biāo)準(zhǔn)的制定中。整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系綜合應(yīng)用在2010年版與2015年版《中國(guó)藥典》(一部)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定與提高中，包括特征圖譜、多成份含量測(cè)定以及超高效液相色譜法三方面。特征圖譜方法于2010年版率先開(kāi)始應(yīng)用，有23個(gè)標(biāo)準(zhǔn)采用了該技術(shù)，2015年版則進(jìn)一步推廣至52個(gè)標(biāo)準(zhǔn)；2005年版《中國(guó)藥典》中僅有35個(gè)中藥標(biāo)準(zhǔn)采用了多成份(≥2)含量測(cè)定，至2015年版，大幅度提高到600余個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，所測(cè)定成份最多達(dá)到8個(gè)，所測(cè)成份不少于3個(gè)的約為180個(gè)；UHPLC的應(yīng)用也于2010年版有了零的突破。整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系同時(shí)也應(yīng)用在《美國(guó)藥典》三七、五味子、薏苡仁、紅參、桂枝，《歐洲藥典》鉤藤、虎杖、水紅花子、澤蘭以及《歐洲藥典論壇》桔梗、魚(yú)腥草等中藥標(biāo)準(zhǔn)制定中。

 

03  “精準(zhǔn)檢測(cè)”-中藥質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新、支撐體系創(chuàng)建及應(yīng)用

 

遵循系統(tǒng)性、普適性和高效性的基本原則，圍繞中藥“精準(zhǔn)檢測(cè)”的目標(biāo)，進(jìn)行了相關(guān)技術(shù)的創(chuàng)新與支撐體系的構(gòu)建。團(tuán)隊(duì)綜合應(yīng)用多維色譜-多模式質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等多種新技術(shù)新方法，創(chuàng)新性地構(gòu)建了符合中藥復(fù)雜體系特點(diǎn)以及廣泛適用的藥效及活性成份的整體質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)，建立了系列中藥檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)和質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)等支撐體系。中藥“精準(zhǔn)檢測(cè)”有力地推動(dòng)了中藥的安全用藥與中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

 

3.1 有效成份高效辨識(shí)技術(shù)

 

基于有效成份開(kāi)展質(zhì)量控制是檢測(cè)方法建立與應(yīng)用的基礎(chǔ)。常規(guī)的中藥活性成份確認(rèn)流程涉及化學(xué)分離、結(jié)構(gòu)確證、藥理篩選等多個(gè)步驟，活性成份辨識(shí)效率低下。中藥所含有效成份化學(xué)類(lèi)別多樣，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中活性成份快速篩選并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，是基于有效成份開(kāi)展質(zhì)量控制的前提條件。

 

本團(tuán)隊(duì)采用多維色譜多模式質(zhì)譜法進(jìn)行活性成份深入表征。中藥有效成份復(fù)雜程度高，同分異構(gòu)體不易分離，微量活性成份不易暴露，采用常規(guī)的液相色譜、液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)困難。因此，團(tuán)隊(duì)通過(guò)多維色譜、多模式質(zhì)譜、數(shù)據(jù)后處理的結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)活性成份的深入表征。以紅花為例，醌式查爾酮碳苷為其主要活性成份，但是該類(lèi)化合物不穩(wěn)定?；谟H水相色譜/反相色譜，構(gòu)建了正交性高達(dá)71%的離線二維系統(tǒng)；線性離子阱串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜，獲取該類(lèi)化合物在碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)與高能碰撞誘導(dǎo)裂解(HCD)兩種裂解模式下互補(bǔ)的碎片信息?；谔卣魉槠^(guò)濾(m/z 119.05)表征了多達(dá)163個(gè)醌式查爾酮碳苷化合物，多于研究前報(bào)道的僅有21個(gè)該類(lèi)化合物[19]。本方法還推廣應(yīng)用于蟾酥[20]、三七葉[3]等十余種中藥的活性成份鑒定。

 

3.2 基于有效成份的定性鑒別技術(shù)

 

薄層色譜串聯(lián)質(zhì)譜法增強(qiáng)信息獲取。高效薄層色譜鑒別法因其操作簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備要求低、通量高，仍是中藥定性鑒別中的主要方法。但傳統(tǒng)的高效薄層色譜法，主要依靠比移值、條帶顏色進(jìn)行鑒別，獲取的化學(xué)信息有限。通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜的方法，發(fā)現(xiàn)靈芝中一個(gè)特征條帶對(duì)應(yīng)4個(gè)靈芝酸類(lèi)成份，大大增強(qiáng)了薄層方法的鑒別性能[21]。該方法應(yīng)用于人參等25種中藥薄層色譜鑒別。

 

選擇離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)下高靈敏表征。薄層鑒別中常存在的問(wèn)題：峰容量小、靈敏度低、供試品制備復(fù)雜。采用選擇離子監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行復(fù)方中有效成份的監(jiān)測(cè)，具有數(shù)據(jù)直觀、方法耐用、靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點(diǎn)?；诩t花多維色譜多模式質(zhì)譜法表征的結(jié)果，團(tuán)隊(duì)建立選擇性監(jiān)測(cè)6個(gè)醌式查爾酮碳苷的方法，實(shí)現(xiàn)丹紅注射液等11種復(fù)方制劑中的紅花檢測(cè)[22]。

 

3.3 基于有效成份的定量比較技術(shù)

 

定量指紋圖譜獲取全面定性定量信息?，F(xiàn)在廣泛應(yīng)用的指紋圖譜技術(shù)僅僅是對(duì)特定色譜分離條件下所得色譜圖的相似度比較，與化合物的含量無(wú)關(guān)，難以準(zhǔn)確反映中藥組份的質(zhì)量狀況。采用定量指紋圖譜技術(shù)對(duì)指紋譜中目標(biāo)成份尤其是有效成份的準(zhǔn)確定量描述使得中藥質(zhì)量控制更加準(zhǔn)確，更能真實(shí)反映中藥的質(zhì)量狀況。

 

3.4 中藥質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)

 

中藥因?yàn)榉N質(zhì)、產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年限、采收等不同，內(nèi)在質(zhì)量存在差異。團(tuán)隊(duì)采用標(biāo)準(zhǔn)方法分析3000批以上的中藥材，構(gòu)建了中藥質(zhì)量大數(shù)據(jù)智能數(shù)據(jù)庫(kù)。為了實(shí)現(xiàn)不同品種比較，團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用統(tǒng)一的提取和指紋圖譜分析方法，建立了中藥材、飲片、配方顆粒及中成藥的標(biāo)準(zhǔn)化分析體系；采用定量指紋圖譜方法完成了1264批次藥材/飲片、2397批次配方顆粒、158批次中成藥的指紋圖譜數(shù)據(jù)采集，獲得了特征指紋圖譜及定性定量信息；開(kāi)發(fā)了品種、基原、產(chǎn)地甄別的核心算法，設(shè)計(jì)了中藥質(zhì)量大數(shù)據(jù)智能分析軟件，實(shí)現(xiàn)了未知藥材/飲片的品種鑒定、藥材/飲片產(chǎn)地和基原的鑒別以及配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

 

3.5 中藥質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)創(chuàng)建

 

團(tuán)隊(duì)基于中藥有效性質(zhì)量檢測(cè)方面的突出工作，獲得國(guó)家發(fā)展改革委員會(huì)和國(guó)家中醫(yī)藥管理局授權(quán)及資金支持，依托上海藥物研究所建設(shè)了國(guó)家中藥質(zhì)量第三方檢測(cè)中心。該平臺(tái)已獲得中國(guó)計(jì)量認(rèn)證(CMA)資質(zhì)認(rèn)定和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)認(rèn)可。目前該平臺(tái)已進(jìn)行市場(chǎng)化運(yùn)營(yíng)，構(gòu)成國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目中的重要支撐體系，可以滿足中藥市場(chǎng)檢測(cè)業(yè)務(wù)需求。

 

綜上，制定一個(gè)科學(xué)可行的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要建立在扎實(shí)的藥效成份等基礎(chǔ)研究上，充分闡釋和明晰中藥的科學(xué)內(nèi)涵；同時(shí)也要充分吸納現(xiàn)代科學(xué)新技術(shù)、新方法，以更好地滿足在中藥質(zhì)量控制過(guò)程中科學(xué)性、可行性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性的相關(guān)需求。