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前言

當(dāng)前，隨著國內(nèi)生物醫(yī)藥的快速發(fā)展，越來越多的生物制藥企業(yè)的產(chǎn)品研發(fā)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。在生物制藥領(lǐng)域里，質(zhì)量源于設(shè)計（QbD)是一種系統(tǒng)化、結(jié)構(gòu)化、基于科學(xué)和風(fēng)險的藥品研發(fā)方法，是一種對產(chǎn)品、工藝和分析方法進(jìn)行科學(xué)有效管理的重要工具。目前單抗領(lǐng)域是生物制藥行業(yè)發(fā)展最快，也是相對成熟的領(lǐng)域之一，關(guān)于QbD的在單抗制品的開發(fā)中應(yīng)用的報道越來越多，本文簡述了單抗制品細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中應(yīng)用QbD的概念和初步想法。

細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝

抗體藥物的原液生產(chǎn)大體可分為上游工藝（又稱細(xì)胞培養(yǎng)）、下游工藝（又稱純化）2個環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都擁有其核心技術(shù)，這些核心技術(shù)環(huán)環(huán)相扣，形成了抗體藥物生產(chǎn)企業(yè)的核心競爭力。一個典型的單抗藥物的商業(yè)化生產(chǎn)流程-上游工藝（細(xì)胞培養(yǎng)）一般采用以下步驟：細(xì)胞復(fù)蘇與傳代→擴(kuò)增培養(yǎng)→細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→細(xì)胞分離（可屬于下游工藝）。

01細(xì)胞復(fù)蘇與傳代

將種子放置在恒溫的水浴鍋中，一般溫度控制在如35℃左右，預(yù)熱如30min，將工作細(xì)胞庫細(xì)胞進(jìn)行解凍復(fù)蘇，根據(jù)工藝要求控制解凍時間，然后將解凍細(xì)胞加入至培養(yǎng)基中，離心分離后轉(zhuǎn)入搖瓶中（如250 mL），進(jìn)行搖瓶傳代。注意控制CO2濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素，同時也要根據(jù)工藝的要求控制接種的密度，控制細(xì)胞活率等要求。將上述的復(fù)蘇種子細(xì)胞按照一定的密度稀釋至新?lián)u瓶中（如500 mL/2000mL），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、搖床搖擺速度、pH等因素，逐漸擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量至滿足一級種子罐的接種要求。

02擴(kuò)增培養(yǎng)（亦稱種子培養(yǎng)）

一級種子培養(yǎng)

將搖瓶種子細(xì)胞按照一定的密度接種到一級種子罐內(nèi)（如20 L），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等因素，逐漸擴(kuò)增至細(xì)胞數(shù)量滿足二級種子罐的要求。

二級種子培養(yǎng)

將一級種子按照一定的密度接種到二級種子罐內(nèi)（如50 L），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等因素，逐漸擴(kuò)增至細(xì)胞數(shù)量滿足三級種子罐的接種要求。

三級種子培養(yǎng)

將二級種子按照一定的密度接種到三級種子罐內(nèi)（如100 L），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等因素，逐漸擴(kuò)增至細(xì)胞數(shù)量滿足細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)的接種要求。

03細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)（亦稱生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)）

種子擴(kuò)增后要進(jìn)入細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)階段，注意控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等因素。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，可采用離心分離或澄清過濾等方法進(jìn)行抗體蛋白的分離純化。

基于QbD理念的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)

質(zhì)量源于設(shè)計（QbD) 核心理念在于“質(zhì)量是通過科學(xué)合理的設(shè)計得以實現(xiàn)的，而不是僅僅依靠最終檢驗出來的”。自2013年起，美國 FDA 對于新的藥品批準(zhǔn)申請，監(jiān)管部門均要求采用QbD方法。近年來，QbD的理念已逐漸成為國內(nèi)企業(yè)大多數(shù)藥品生產(chǎn)和研發(fā)企業(yè)共識，在單抗制品的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)中應(yīng)用的報道越來越多，基于QbD理念的藥品開發(fā)基本流程，ICH Q8中提到的質(zhì)量源于設(shè)計QbD的方法如下圖所示：

基于QbD理念的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)：首先要界定目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量概況（QTPP），即以預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概括（QTPP）為研發(fā)的起點(diǎn)，在了解關(guān)鍵物質(zhì)屬性（CMA）的基礎(chǔ)上，通過試驗設(shè)計（DOE），理解產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），確立關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP），在原料特性、工藝條件、環(huán)境等多個影響因素下，建立能滿足產(chǎn)品性能的且工藝穩(wěn)健的設(shè)計空間（DS），并根據(jù)設(shè)計空間，建立質(zhì)量風(fēng)險管理，確立質(zhì)量控制策略和藥品質(zhì)量體系，整個過程強(qiáng)調(diào)對產(chǎn)品和生產(chǎn)的認(rèn)識。QbD可以幫助我們更好地理解產(chǎn)品和工藝，增強(qiáng)單抗制品的穩(wěn)定性，降低GMP生產(chǎn)的復(fù)雜性和成本等。

那么細(xì)胞培養(yǎng)過程中設(shè)計空間如何確定一直是大家都感興趣的話題，自從2021年6月25日，CDE發(fā)布實施《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，正式在官方指導(dǎo)原則提到設(shè)計空間的概念，一石激起千層浪，下面我就來分享一下細(xì)胞培養(yǎng)過程中設(shè)計空間確定的流程，因為個人認(rèn)知的局限性，如有不足，歡迎留言補(bǔ)充。細(xì)胞培養(yǎng)操作空間一般由申辦者在注冊時提出，監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如CDE）評估和批準(zhǔn)，在設(shè)計空間的確定過程中，需要量化不同參數(shù)對工藝過程產(chǎn)品表現(xiàn)的影響：如產(chǎn)量和質(zhì)量，按影響程度通常分為非重要工藝參數(shù)（Non-KPP），重要工藝參數(shù)（KPP）、關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP），細(xì)胞培養(yǎng)過程中設(shè)計空間（DS）確定流程一般如下（可供參考），

01評估細(xì)胞培養(yǎng)過程中所有工藝過程參數(shù)

首先以適當(dāng)?shù)脑u估工具（如FMEA）評估細(xì)胞培養(yǎng)過程中所有工藝過程參數(shù)，確定細(xì)胞培養(yǎng)工藝表征中需要研究的參數(shù)，因不同生物制品自身特點(diǎn)不同，細(xì)胞培養(yǎng)過程中工藝過程參數(shù)也會有所差別，評估后的工藝表征中需要研究的參數(shù)也會有所差別。因此相關(guān)研究人員須具備足夠的培養(yǎng)工藝知識積累、風(fēng)險評估和風(fēng)險管控的能力。在實施評估時，基于風(fēng)險，前瞻性設(shè)計研究方案，開展充分的研究，不同階段細(xì)胞培養(yǎng)，評估的參數(shù)對象也會有所差別，一般情況下分細(xì)胞復(fù)蘇與傳代、各級種子培養(yǎng)、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)分別進(jìn)行評估細(xì)胞培養(yǎng)過程相關(guān)工藝過程參數(shù)，如某藥企大規(guī)模生產(chǎn)階段細(xì)胞培養(yǎng)過程相關(guān)工藝過程參數(shù)如下表：

02建立工藝縮小模型

其次建立工藝縮小模型；在縮小模型基礎(chǔ)上，進(jìn)行試驗設(shè)計（DOE）參數(shù)篩選實驗，去除非重要工藝參數(shù)（Non-KPP），確定重要工藝參數(shù)（KPP），對影響產(chǎn)品質(zhì)量的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計（RSM）實驗設(shè)計，建模，確定關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）操作空間，如在風(fēng)險評估階段確定了生產(chǎn)培養(yǎng)步驟中的4個潛在的關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）(IVCD、Culture duration、pH和Temperature)，最后進(jìn)行最差條件實驗進(jìn)行操作空間確認(rèn)，確認(rèn)的范圍如下表：