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筆者在參考多篇學(xué)術(shù)文章后，決定再補(bǔ)充PF-07321332設(shè)計(jì)背后隱含的細(xì)節(jié)，方便大家更好的理解。

 

病毒常見(jiàn)靶點(diǎn)：蛋白酶

 

冠狀病毒基因組在復(fù)制過(guò)程中，需要將polyprotein裂解為非結(jié)構(gòu)蛋白，而將polyprotein裂解的過(guò)程是由3CL蛋白酶和PL蛋白酶完成的。由于3CL蛋白酶只切割谷氨酰胺（Gln）殘基后的多肽，目前還沒(méi)有已知的人類蛋白酶顯示出與3CL蛋白酶相同的切割特異性，因此3CL蛋白酶作為SARS-CoV-2的潛力靶點(diǎn)受到極大關(guān)注。

 

病毒的蛋白酶是開(kāi)發(fā)小分子抗病毒口服藥物的常見(jiàn)靶點(diǎn)，其中最有代表性的藥物當(dāng)屬HIV和HCV蛋白酶抑制劑。圖1和圖2列舉了已上市的HIV和HCV蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)，其中的ritonavir（圖1標(biāo)紅，用作CYP3A4抑制劑減緩PF-07321332的代謝分解）和boceprevir（圖2標(biāo)紅，部分片段與PF-07321332相同）都與輝瑞的新冠藥物有一定關(guān)聯(lián)。

 

 

圖1.部分FDA獲批上市的HIV蛋白酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的上市年份。

 

圖2.FDA獲批上市的HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的上市年份（由于后來(lái)有更好的治療藥物上市，都已停止生產(chǎn)）。

 

3CL蛋白酶，因其切割位點(diǎn)與picornavirus的3C蛋白酶很相似而得名。人鼻病毒（HRV）則是最常見(jiàn)的picornavirus。Rupintrivir是人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶抑制劑（也是第一個(gè)進(jìn)入臨床的3C蛋白酶抑制劑），但由于II臨床結(jié)果不理想而終止研發(fā)。之前的文章已經(jīng)提到輝瑞在SARS期間在保留rupintrivir的Michael受體的基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到活性很好的PF-00835231分子。而PF-00835231的優(yōu)化過(guò)程，其實(shí)是和3CL蛋白酶的催化機(jī)理密切相關(guān)的。

 

圖3. Rupintrivir與輝瑞在SARS期間的發(fā)現(xiàn)的PF-00835231的分子結(jié)構(gòu)。

 

特征催化機(jī)理和底物分析發(fā)現(xiàn)保守片段

 

3CL蛋白酶對(duì)底物水解的催化機(jī)理如圖4所示，可以發(fā)現(xiàn)3CL蛋白酶的活性位點(diǎn)包含Cys145和His41，二者形成一個(gè)催化二聯(lián)體，對(duì)識(shí)別底物起到關(guān)鍵作用。因此，通過(guò)模仿3CL蛋白酶的天然肽底物，引入特定的“共價(jià)彈頭”（ 如Michael受體、羰基和氰基等）與Cys145共價(jià)結(jié)合是很直接的思路。 

 

圖4. SARS/SARS-CoV-2的3CL蛋白酶的底物水解機(jī)理。From：JMC 2016

 

通過(guò)對(duì)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的pp1ab polyprotein序列進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)SARS和SARS-CoV-2的3CL蛋白酶的底物有特異性的P1（Gln，Q）和高度保守的P2位點(diǎn)（Leu，L）。P3、P4則分別以T/K/R/V和A/V/P/T為主。

 

圖5. SARS-CoV-2和SARS-CoV的3CL蛋白酶識(shí)別polyprotein的裂解位點(diǎn)，數(shù)據(jù)來(lái)源于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的pp1ab polyprotein序列。From：Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters 2020

 

如圖6所示，2020年VincenzoSumma等人在JMC總結(jié)了3CL蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)特征：P1和P2位點(diǎn)基本都參照Gln和Leu改造；P3/P4位點(diǎn)則一般是用來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化改善溶解性、滲透性和口服利用度等成藥性；“共價(jià)彈頭”則以羰基和Michael受體為主。

 

圖6. SARS-CoV-2的3CL蛋白酶擬肽共價(jià)抑制劑的主要特征。From：JMC 2020 

 

看到這里，其實(shí)就不難理解輝瑞的PF-00835231的優(yōu)化過(guò)程，PF-00835231的P1/P2就是參考保守的Gln和Leu，而可調(diào)節(jié)的P3部分（吲哚環(huán)）有可能是參考了Trp的側(cè)鏈設(shè)計(jì)的。

 

藥化改造提高分子口服利用度

 

下面從3個(gè)具體的分子來(lái)分析3CL蛋白酶的設(shè)計(jì)思路，分別是四川大學(xué)楊勝勇老師團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的MI-09、MI-30和輝瑞的PF-07321332?？梢悦黠@的發(fā)現(xiàn)，楊老師團(tuán)隊(duì)和輝瑞的科學(xué)家都不約而同的在保守的P1和P2選擇了環(huán)化的Gln和Leu（增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的剛性，減少結(jié)合時(shí)的構(gòu)象熵，同時(shí)提高logP和滲透性）；對(duì)于P3，一般是根據(jù)結(jié)合的口袋環(huán)境、同時(shí)改善滲透性和口服利用度來(lái)設(shè)計(jì)；而“共價(jià)彈頭”則分別是選用了羰基和氰基。

 

圖7.四川大學(xué)楊勝勇老師團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的MI-09、MI-30和輝瑞的PF-07321332的分子結(jié)構(gòu)。

 

具體的改造思路如圖8所示，Gln一般是改造為γ-lactam，根據(jù)楊老師和輝瑞的引用文獻(xiàn)，應(yīng)該都有參考rupintrivir的γ-lactam片段。對(duì)于Leu，楊老師團(tuán)隊(duì)是根據(jù)共晶結(jié)構(gòu)沿用了HCV的NS3/4A蛋白酶抑制劑boceprevir和telaprevir的P2片段；而輝瑞的分子也同樣有boceprevir的P2片段。對(duì)于相對(duì)疏水的S3口袋（P3對(duì)應(yīng)的3CL蛋白酶的口袋環(huán)境），兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都選擇了相對(duì)疏水且都含有CF3的側(cè)鏈（輝瑞的P3還有點(diǎn)類似底物保守殘基Val）。

 

圖8.輝瑞的PF-07321332的藥化設(shè)計(jì)策略分析。

 

小結(jié)

 

本文探討了PF-07321332設(shè)計(jì)的一些細(xì)節(jié)，背后主要是3CL蛋白酶的擬肽抑制劑的設(shè)計(jì)策略。

 

1、由于3CL蛋白酶特異性的催化機(jī)理，抑制劑的設(shè)計(jì)都會(huì)保留高度保守的P1（Gln）和P2（Leu）；

 

2、從藥化角度出發(fā)，Gln和Leu通常會(huì)被改造為環(huán)狀，借鑒了感冒藥rupintrivir的γ-lactam片段和HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑的氮雜雙環(huán)；

 

3、為了提高抑制劑的滲透性和口服利用度，一般要改造P3和“共價(jià)彈頭”。

 

PF-07321332很大概率會(huì)很快上市，屆時(shí)應(yīng)該是3CL蛋白酶的首個(gè)上市分子。了解輝瑞的研發(fā)過(guò)程后，不難發(fā)現(xiàn)活性很好的分子其實(shí)早在SARS期間就被發(fā)現(xiàn)了，而且優(yōu)化到PCC的過(guò)程并不算復(fù)雜，縱觀小分子研發(fā)的速度，這絕對(duì)是神速了，但在新冠的背景下還是讓人感覺(jué)不夠快。最后，新冠口服藥物的開(kāi)發(fā)應(yīng)該還會(huì)繼續(xù)。縱觀HIV和HCV的藥物研發(fā)過(guò)程，由于病毒易出現(xiàn)耐藥突變，“雞尾酒療法”（不同機(jī)制的藥物聯(lián)合用藥）幾乎是發(fā)展的必然趨勢(shì)，相信與PF-07321332聯(lián)合用藥的臨床實(shí)驗(yàn)也在提上歷程了。

 

參考文獻(xiàn)：

 

1. Thanigaimalai Pillaiyar, et al. "An Overview of Severe Acute Respiratory Syndrome−Coronavirus (SARS-CoV) 3CL Protease Inhibitors: Peptidomimetics and Small Molecule Chemotherapy". J. Med. Chem. 2016, 59, 6595–6628

2. Vincenzo Summa, et al. "Targeting SARS-CoV?2 Proteases and Polymerase for COVID-19 Treatment: State of the Art and Future Opportunities". J. Med. Chem. November 13, 2020

3. Christoph Nitsche, et al. "The SARS-CoV-2 main protease as drug target". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 30 (2020) 127377

4. Robert L. Hoffman, et al. "Discovery of Ketone-Based Covalent Inhibitors of Coronavirus 3CL Proteases for the Potential Therapeutic Treatment of COVID-19". J. Med. Chem. 2020, 63, 21, 12725–12747

5. Shengyong Yang, et al. "Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease in complex with protease inhibitor PF-07321332".Science 371, 1374–1378 (2021)

6. DAFYDD R. OWEN, et al. "An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19". Science 2 Nov 2021