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摘要：納米抗體作為一種可塑性強(qiáng)、較為新穎的抗原識(shí)別和調(diào)控的工具，具備小尺寸、易表達(dá)和篩選及改造、高親性和穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，能夠識(shí)別傳統(tǒng)抗體難以識(shí)別的較為隱匿的抗原表位，在診斷治療各種疾病及檢測(cè)方面的應(yīng)用不斷深入，且在基礎(chǔ)研究中也發(fā)揮著不可替代的作用。文中主要介紹了納米抗體及其衍生結(jié)構(gòu)在小分子化合物及病原微生物檢測(cè)和疾病的診斷，以及在疾病靶向治療，細(xì)胞、分子成像領(lǐng)域的相關(guān)進(jìn)展，此外還綜述了在蛋白質(zhì)構(gòu)象研究領(lǐng)域展現(xiàn)的廣闊前景。

1993年科學(xué)家首次報(bào)道了駱駝中存在一種天然缺失輕鏈、通過(guò)重鏈上的可變區(qū)結(jié)合抗原的重鏈抗體 (heavy chain antibodies, HCAb)，之后陸續(xù)在羊駝、單峰駝和美洲駝等駝科[1]，以及鯊魚、鰩魚等軟骨魚中同樣發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)構(gòu)的抗體 [2]。人們?cè)谥劓溈贵w可變區(qū)片段(variable domain of the heavy chain of heavychain antibody, VHH) 基礎(chǔ)上開發(fā)了一種僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成的單域抗體 (single domain antibody, sdAb)，長(zhǎng) 4 nm，直徑 2.5 nm，分子量為 12–15 kDa[3]，是目前已知最小的活性抗原結(jié)合蛋白，僅為傳統(tǒng)抗體大小的十分之一[4]，也被稱為納米抗體 (nanobody, Nb)，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的特性使其成為多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。駱駝是絲綢之路文化的象征，寧夏回族自治區(qū)位于絲綢之路上，駱駝資源豐富且有著得天獨(dú)厚的自然養(yǎng)殖條件，全國(guó)約有駱駝30萬(wàn)峰，主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、青海、甘肅、寧夏等地區(qū)約110萬(wàn) km2的干旱荒漠草原上，本實(shí)驗(yàn)室作為西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，立足西部地區(qū)牛羊養(yǎng)殖業(yè)、馬鈴薯產(chǎn)業(yè)、中藥材產(chǎn)業(yè)和生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)等特色資源和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，針對(duì)制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題開展科學(xué)研究，現(xiàn)已開展部分研究工作對(duì)駝源納米抗體在小分子化合物檢測(cè)和病原菌感染方面進(jìn)行了基礎(chǔ)性探究。

 

1 納米抗體優(yōu)勢(shì)

 

納米抗體抗原結(jié)合區(qū)由單個(gè)域組成，分子量小，組織滲透性高，可快速、均勻擴(kuò)散，利于其穿透致密組織發(fā)揮作用，為各類疾病提供新的治療方法[5-6]；Nb的VHH域與傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū) (variable region of the heavy chain of conventional antibodies, VH) 域有較高的同源性，同人源抗體 VH相比，VHH有較長(zhǎng)的互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region 1, CDR1) 和CDR3區(qū)，伸長(zhǎng)的CDR3環(huán)為納米抗體的多種研究提供了可能，且與傳統(tǒng)抗體的VH結(jié)構(gòu)域[7](圖 1) 相比，Nb的框架區(qū) (framework region, FR) 內(nèi)維持 VH/VL相互作用的疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸，提高了溶解性和穩(wěn)定性[8]，因此通過(guò)設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)人源化改造；可能由于Nb凸起的對(duì)角和靈活的長(zhǎng)CDR3環(huán)，形成loop環(huán)與蛋白質(zhì)空間構(gòu)象上的裂隙和空腔結(jié)合，從而能識(shí)別空腔和隱蔽的凹形表位如酶活性位點(diǎn)和隱匿病毒表位，這意味著Nb有助于預(yù)測(cè)新的潛在生物靶標(biāo)及發(fā)現(xiàn)新的藥理靶點(diǎn)，還可用作酶抑制劑[9]；Nb在惡劣環(huán)境如極端溫度和pH條件下表現(xiàn)出優(yōu)異的耐受性，更易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸[10]；Nb目前已經(jīng)容易大規(guī)模、低成本地在多種系統(tǒng)中表達(dá)，具備易篩選和純化、相對(duì)較低的生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)，在大腸桿菌和酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目前已可高水平表達(dá)，且在煙草植物、擬南芥、水稻、大豆等植物表達(dá)系統(tǒng)中已成功表達(dá)了納米抗體，此表達(dá)系統(tǒng)顯示出了獨(dú)特的優(yōu)越性[11-12]；此外通過(guò)基因工程操作可實(shí)現(xiàn)重塑化設(shè)計(jì)，Nb的可組合性意味著通過(guò)寡聚可增加其親和性或血清半衰期，進(jìn)而發(fā)揮藥物在靶器官內(nèi)的功能，目前除了單價(jià)納米抗體，人們致力于雙價(jià)VHH、雙特異性VHH、多價(jià)VHH以及融合VHH的研究，來(lái)增強(qiáng)其對(duì)目標(biāo)的特異性以及功能性等特性，即有利于藥物發(fā)揮其高效作用[13]。納米抗體具有分子小、水溶性好、親和性和穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、易于表達(dá)生產(chǎn)且能進(jìn)一步修飾等優(yōu)點(diǎn)，在多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)都有極大的應(yīng)用前景(表 1)。

 

 

2檢測(cè)、診斷和治療

 

2.1 小分子化合物檢測(cè)

 

納米抗體在環(huán)境污染物、生物毒素等小分子化合物的檢測(cè)中不僅降低了檢測(cè)下限，提高了靈敏度和精確度，而且通過(guò)優(yōu)化測(cè)定過(guò)程，能夠?qū)崿F(xiàn)快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)，推動(dòng)免疫檢測(cè)方法和傳感技術(shù)的快速發(fā)展，Nb在競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA法、免疫 PCR、熒光偏振免疫分析和橫流免疫分析等免疫檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)中取得了令人滿意的成果[36]。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)Liu等[37]用半抗原CBR1與鑰孔血藍(lán)蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 偶聯(lián)，將CBR1-KLH進(jìn)行皮下免疫羊駝，然后經(jīng)提取總 RNA、PCR擴(kuò)增VHH片段、酶切、轉(zhuǎn)化等步驟后成功構(gòu)建VHH庫(kù)，構(gòu)建的文庫(kù)大小約為1×108 CFU/mL，經(jīng)過(guò)洗脫、淘選、純化等一系列過(guò)程后制備了甲萘威特異性VHHs，開發(fā)了基于Nb的免疫測(cè)定方法檢測(cè)谷物中的廣譜氨基甲酸酯類殺蟲劑甲萘威(carbaryl)，且在谷物樣品中的可重復(fù)性和再現(xiàn)性良好，本課題組參與了其中的部分研究工作，對(duì)基于Nb的小分子檢測(cè)有了一定的研究基礎(chǔ)。

Nb在農(nóng)藥獸藥殘留以及重金屬檢測(cè)中表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。Li 等[38]研究發(fā)現(xiàn)納米抗體-堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP) 對(duì)除草劑 2,4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-D) 表現(xiàn)出優(yōu)異的敏感性和特異性 (IC50=29.2 ng/mL)，2,4-D深埋在CDR3和CDR2形成的袋中，NB3-9的結(jié)合袋通過(guò)氫鍵和疏水力與 2,4-D的相互作用，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了以納米抗體-堿性磷酸酶(AP) 融合為基礎(chǔ)的2,4-D一步熒光酶免疫測(cè)定法 (one-step fluorescent enzyme immunoassay, FLEIA)，通過(guò)分析比較確定了FLEIA法可作為一種監(jiān)測(cè)環(huán)境中 2,4-D殘留的便捷工具。3-苯氧基苯甲酸(3-PBA) 被廣泛用作人類擬除蟲菊酯類殺蟲劑暴露的常見生物標(biāo)志物，近期El-Moghazy等[39]研制了一種基于納米抗體的新型電化學(xué)競(jìng)爭(zhēng)免疫傳感器用于3-PBA的快速檢測(cè)，檢測(cè)限為0.64 pg/mL，檢測(cè)限遠(yuǎn)低于膠體金/單克隆抗體/側(cè)向流動(dòng)免疫分析方法，LOD為 130ng/mL[40]。

Nb在檢測(cè)食品和環(huán)境真菌毒素方面展現(xiàn)了強(qiáng)大的應(yīng)用前景。Wang等[41]開發(fā)并優(yōu)化了PO8-VHH 的納米抗體-多克隆抗體夾心ELISA法測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中的曲霉病菌，能夠達(dá)到1μg/mL濃度的檢測(cè)效果，進(jìn)而監(jiān)測(cè)農(nóng)產(chǎn)品曲霉污染。Tang 等[42]使用OTA和抗OTA Nb分別與兩種尺寸的高效熒光標(biāo)簽-量子點(diǎn) (quantum dot, QD) 共價(jià)耦合，制備了OTA標(biāo)記的GQD結(jié)合物(OTA-GQD) 和Nb28標(biāo)記的RQD偶聯(lián)物(Nb-RQD) 分別作為能量供體和受體，如圖2所示，開發(fā)出一種Nb-FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移) 免疫傳感器用于檢測(cè)谷物樣品中赭曲霉毒素A (ochratoxin, OTA)，易于表達(dá)、小尺寸的Nbs可以縮短兩個(gè) QD之間的有效距離，從而提高檢測(cè)靈敏度，單步測(cè)定可以在5min 內(nèi)完成，檢測(cè)限為5pg/mL。

 

 

2.2病原體感染診斷工具

 

納米抗體在病原菌引起的感染診斷方面的突出表現(xiàn)，可以為疾病的早期診斷提供便捷，幫助我們快速控制疾病的惡化并達(dá)到治療的目的。

牛結(jié)核病是一種主要由于感染結(jié)核分枝桿菌發(fā)病且死亡率極高的慢性人畜共患傳染病，研究發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核分枝桿菌表達(dá)多個(gè)分泌蛋白，其中 Ag85B 是牛結(jié)核分枝桿菌主要的分泌蛋白之一[43]，本課題組已經(jīng)成功構(gòu)建了抗牛結(jié)核分枝桿菌 VHH 抗體庫(kù)，且以Ag85B蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術(shù)經(jīng)淘選并富集及蛋白芯片互作技術(shù)篩選得到抗Ag85B的VHH抗體，為牛結(jié)核病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)[44]。

沙門氏菌引發(fā)的食物中毒占據(jù)食物中毒首列，He等[45]在對(duì)免疫駱駝納米抗體庫(kù)進(jìn)行生物淘選后，首次分離出了針對(duì)腸炎沙門氏菌的納米抗體，將C端含有6×His標(biāo)簽標(biāo)記的3個(gè)納米抗體的質(zhì)粒亞克隆到大腸桿菌Top10F′中，通過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG) 誘導(dǎo)過(guò)夜表達(dá)，并用Ni-NTA親和柱進(jìn)行純化，最后開發(fā)了一種基于Nb13的夾心 ELISA法用于牛奶樣品中的腸炎沙門氏菌檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)1.4×105 CFU/mL。

錐蟲病是一種由寄生蟲引起的睡眠病。Pinto等[46]通過(guò)質(zhì)譜選擇后鑒定出一對(duì)特異性針對(duì)錐蟲丙酮酸激酶 (TcoPYK) 的Nb對(duì) (Nb44/Nb42)，并建立了兩種異源夾心試驗(yàn)法：側(cè)向流動(dòng)側(cè)流法 (LFAs) 和ELISA法用于檢測(cè)感染小鼠和牛血漿樣本中的寄生蟲病，測(cè)定LOD分別為220ng/mL 和14ng/mL，LFAs展示出了良好的特異性 (92%)。

2010年在中國(guó)首次報(bào)道的蜱傳病毒發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒 (severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV) 可導(dǎo)致人患發(fā)熱伴血小板減少綜合征 (severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)。吳喜林等[47]通過(guò)篩選SFTS獲得特異性結(jié)合SFTSV表面糖蛋白 (glycoprotein, GN) 的納米抗體 VHH，鑒定 CDR 序列并構(gòu)建了人源化的VHH-HUFC1 (SNB抗體)，通過(guò)試驗(yàn)表明SNB抗體可應(yīng)用于SFTSV的檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，即納米抗體雙抗體夾心ELISA檢測(cè)sGN蛋白從而檢出 SFTSV病毒，其中SNB01與SNB37的雙抗組合檢測(cè)SFTSV真病毒的靈敏度為3.75×106gc/mL。

 

2.3疾病診斷工具

 

準(zhǔn)確的疾病診斷是指導(dǎo)臨床治療的關(guān)鍵步驟，納米抗體成像技術(shù)及疾病診斷研究需要較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，不斷地應(yīng)用創(chuàng)新使得Nbs成為疾病診斷的理想選擇。Nb擁有體積小、易滲透、快速腎臟清除的優(yōu)勢(shì)，可用放射性核素[17]、熒光探針、酶示蹤劑、生物素或不同的藥物等[48]分子進(jìn)行標(biāo)記，與分子成像技術(shù)相結(jié)合從而優(yōu)化成像系統(tǒng)，因此Nbs作為良好的示蹤劑，成為了體外和體內(nèi)成像的理想選擇。正電子發(fā)射斷層掃描 (positron emission computed tomography, PET) 和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層顯像 (single-photon emission computed tomography, SPECT)[49-50]中，可分別用正電子發(fā)射核素 (如18F、68Ga或89Zr) 和 γ-發(fā)射核素 (如 99mTc 等) 標(biāo)記 Nbs進(jìn)行成像；在超聲成像中，可使用Nbs提高造影劑 (如微泡和納米泡[18]) 的穿透力強(qiáng)及信號(hào)，主要用于可視化血管系統(tǒng)[51]；特別是在腫瘤診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，檢測(cè)癌細(xì)胞本身、生物標(biāo)志物、可視化與癌細(xì)胞周圍環(huán)境密切相關(guān)的成分成為診斷和監(jiān)測(cè)的有效策略，有研究表明[52]在原位臨床前模型中，抗 HER2的Nbs 2Rs15d成功地檢測(cè)到HER2陽(yáng)性的腦病變，除此之外，表皮生長(zhǎng)因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)、前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)、CD20和CD38[50]等也被作為癌細(xì)胞成像的目標(biāo)抗原展開研究；巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是許多免疫療法失敗的元兇，巨噬細(xì)胞甘露糖受體蛋白 (MMR, CD206) 在促腫瘤的巨噬細(xì)胞上高度表達(dá)，99mTc標(biāo)記的抗 MMR Nbs可用于SPECT/CT對(duì)小鼠乳腺癌和肺腺癌的可視化[53]；抗血管細(xì)胞粘附分子-1 (vasculature cell adhesion molecule-1, VCAM-1) 的Nbs已被用于標(biāo)記微泡，并應(yīng)用于腫瘤血管的可視化超聲成像，對(duì)小鼠注射10min后腫瘤內(nèi)可見超聲造影信號(hào)持續(xù)，且信號(hào)明顯高于對(duì)照。此外，還用于炎癥性疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的成像，為了以高靈敏度監(jiān)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化病變，Bridoux 等[54]使用了一種基于Nb的示蹤劑 (cAbVCAM1-5) 靶向血管細(xì)胞粘附分子-1 (VCAM-1)，將RESCA螯合劑偶聯(lián)到cAbVCAM1-5 Nb上，并用[18F]AlF進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)PET/CT 可視化載脂蛋白e基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。對(duì)于光學(xué)成像，Nbs被熒光染料標(biāo)記，并通過(guò)非侵入性的體內(nèi)成像方式、體內(nèi)顯微鏡和體外流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[15,55]。在結(jié)直腸癌 (colorectal cancer, CRC) 早期初篩以及輔助診斷方面，Nb 作為親和試劑來(lái)開發(fā)糞便免疫化學(xué)檢測(cè) (fecal immunochemical tests, FITs) 用于檢測(cè)人類糞便樣品中的血紅蛋白(hHg) 顯示出優(yōu)異的再現(xiàn)性和精確度，可作為早期結(jié)直腸癌的大規(guī)模群體篩查工具[56]，這克服了結(jié)腸鏡檢查前的飲食限制及檢查時(shí)的侵入性，提高了患者的可接受度。這些技術(shù)有助于我們探究疾病的發(fā)生過(guò)程及了解發(fā)病機(jī)制，在早期捕獲較高的病變信號(hào)，進(jìn)行無(wú)損傷實(shí)時(shí)成像，方便疾病的預(yù)后觀察，在內(nèi)窺鏡檢查過(guò)程中或在熒光引導(dǎo)的手術(shù)背景下用于可視化表面病變。

 

2.4 疾病治療

 

2.4.1 靶向腫瘤治療

 

Nb在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、感染性疾病、腫瘤學(xué)和炎癥性疾病中均表現(xiàn)出優(yōu)異的應(yīng)用價(jià)值和前景 (表 2)，主要聚焦于腫瘤治療且已經(jīng)取得了顯著成效，納米抗體-藥物偶聯(lián)[18]、CAR-T[57-58]、光動(dòng)力療法 (PDT)[59]、靶向放射性核素治療等治療方法的不斷研發(fā)改進(jìn)為患者帶來(lái)了新的希望。

 

 

Altintas等[60]研發(fā)了一種核心由EGFR靶向納米抗體與PEG (EGa1-PEG) 結(jié)合的納米粒子(NANAP)，NANAP中裝載有多激酶抑制劑17864，在溶酶體吸收和消化后，激酶抑制劑在細(xì)胞內(nèi)釋放，抑制 EGFR 陽(yáng)性的 14C 鱗狀頭頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Fang等[61]將藥物美登素 (DM1) 與MHC-Ⅱ靶向納米抗體 VHH7結(jié)合，通過(guò)NIR成像及向健康小鼠和荷瘤小鼠注射VHH7-AF47，解剖后比較熒光信號(hào)證實(shí)了淋巴瘤在肺、肝、脾、淋巴結(jié)等器官中的存在且肝臟中有轉(zhuǎn)移灶，腫瘤浸潤(rùn)導(dǎo)致脾腫大，并證實(shí)了VHH7對(duì)轉(zhuǎn)移灶的靶向性，用 A20細(xì)胞系作為模型，VHH7-DM1治療組腫瘤明顯小于對(duì)照組，小鼠平均存活時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，可顯著抑制肝臟病灶轉(zhuǎn)移。CD7分子黏附抗體或抗體衍生物后可快速發(fā)生內(nèi)吞作用，Tang等[62]以單價(jià)和雙價(jià)抗-CD7納米抗體為基礎(chǔ)構(gòu)建了免疫毒素，并將其編碼為PG001和PG002，采用WST-8法測(cè)定細(xì)胞毒活性，兩者分別在納摩爾 (PG001) 和皮摩爾 (PG002) 濃度下能誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞系的高效抗原特異性凋亡，能有效、選擇性地殺傷人白血病細(xì)胞，顯著延長(zhǎng)治療后小鼠的存活時(shí)間。

放射性標(biāo)記的納米抗體也有望成為靶向放射性核素治療的靶向藥物。其中α粒放射性核素正在用于臨床或臨床前評(píng)估，2Rs15d是一個(gè)HER-2特異性納米抗體，Pruszynski 等[63]利用2Rs15d納米抗體與偶聯(lián)劑2-(4-異硫氰基芐基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)，并用α發(fā)射性核素錒-225標(biāo)記 (α-225Ac)，產(chǎn)生225Ac-DOTA-Nb，這種靶向納米抗體可以為靶細(xì)胞提供高致死性和局部化的放射治療。

納米抗體可充當(dāng)光敏劑 (photosensitizer, PS) 的載體，用于靶向光動(dòng)力療法 (photodynamic therapy, PDT)，通常臨床上使用疏水的光敏劑，不能提供腫瘤特異性。增加腫瘤細(xì)胞特異性受體的表達(dá)水平可以用于靶向這些細(xì)胞，即增加腫瘤對(duì)光敏劑的特異性攝取，如過(guò)度表達(dá)的EGFR等[64]常被用作靶向治療的靶點(diǎn)。采用納米抗體的PDT可將周圍細(xì)胞的損害降低，納米抗體-PS 共軛物選擇性地結(jié)合到靶標(biāo)上，并且在照明后能夠在體外誘導(dǎo)選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞。

 

2.4.2 病毒感染治療

 

Nb還是中和抗病毒試劑的豐富來(lái)源，可作為治療動(dòng)、植物病毒感染的理想工具。SARS-冠狀病毒-2 (SARS-CoV-2) 的出現(xiàn)導(dǎo)致了一種全球性的流行病，比以往的冠狀病毒傳播性更強(qiáng)，不同的納米抗體已經(jīng)被開發(fā)用于高親和力結(jié)合受體結(jié)合域 (RBD)，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制RBD與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2) 的相互作用并中和病毒[65-67]，Nb 主要依賴于3個(gè)可變環(huán)，即圖1中的 CDR1、CDR2、CDR3形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)，Nb相關(guān)技術(shù)的成熟揭示其可作為高效的中和劑，抵御致病性冠狀病毒的侵襲。Strokappe等[68]成功構(gòu)建了靶向 HIV gp41和gp120包膜蛋白的中和性納米抗體，這些新的雙特異性 VHH有成為治療劑或殺菌劑的潛力。BBMV是一種種子傳播的植物病毒，Ghannam 等[69]通過(guò)噬菌體展示生物淘選分離出8個(gè)BBMV特異性納米抗體，其中3個(gè)成功地抑制了BBMV在體外的傳播且在蠶豆中表達(dá)時(shí)能中和BBMV。Orlov等[70]分離出抑制葡萄扇葉病毒 (grapevine fanleaf virus, GFLV) 的納米抗體 Nb23，在煙草和該病毒的天然宿主葡萄砧木中穩(wěn)定表達(dá)并觀察到了對(duì) GFLV 強(qiáng)烈的特異性抵抗力。

 

2.4.3 抗菌素治療

 

抗生素療法是治療細(xì)菌性感染的主要手段，但由于抗生素不合理、過(guò)度的使用，導(dǎo)致耐藥菌甚至超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，對(duì)于嚴(yán)重感染的病例，抗生素已經(jīng)無(wú)法發(fā)揮其抗菌抑菌的作用。而納米抗體由于特異性強(qiáng)，能精確結(jié)合致病細(xì)菌表面抗原，拮抗細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，從而治療由細(xì)菌引起的感染性疾病，成為開發(fā)抗菌治療的新方式。納米抗體通過(guò)拮抗細(xì)菌黏附、運(yùn)動(dòng)以及細(xì)菌毒力因子等不同方式對(duì)抗細(xì)菌感染，減少致病菌黏附，如通過(guò)選擇能夠抑制細(xì)菌在上皮細(xì)胞粘附的抗表面抗原的 VHH，可用于預(yù)防菌源性腹瀉[71]。此外，納米抗體還可以防止細(xì)菌或細(xì)菌毒素進(jìn)入細(xì)胞，如VHH R303[72]與內(nèi)化蛋白B (internalin B, Inl B) 上 c-Met作用位點(diǎn)結(jié)合，能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制李斯特菌入侵赫拉細(xì)胞，進(jìn)一步研究結(jié)果表明其可用于治療和預(yù)防李斯特菌病。

 

2.4.4 納米抗體作為解毒劑治療

 

在許多國(guó)家，蛇、蝎子、蜘蛛等的毒液嚴(yán)重危害人類健康。研究表明，納米抗體具有良好的中和能力，Jinkins 等[73]成功分離出對(duì)α-眼鏡蛇毒素 (α-Cbtx) 具有很高親和力的VHHs (C2和 C20)，它們能夠完全中和α-Cbtx 的致死作用。Calderon 等[74]開發(fā)了一套針對(duì)黃腭蛇毒出血性和肌毒成分的納米抗體，通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)確定了Nbs H6、H8 和 H9具有最好的蛇毒出血作用中和活性，Nbs M28、M35、M43、M67、M85和M88可作為較好的肌毒作用抑制劑。Ahmadi 等[75]總結(jié)了幾種蝎子毒液治療的抗毒劑，與傳統(tǒng)抗毒劑相比，納米抗體因其具有較高的體外穩(wěn)定性和低的免疫原性，具有發(fā)展為下一代蝎子抗毒血清的潛力，如有研究表明anti-HNc 納米抗體能夠?qū)Χ拘腍Nc 類毒素的侵害提供完全的保護(hù)，一種雙特異性NbF12-10展現(xiàn)了出色的毒液中和能力，對(duì)致命的蝎子蜇傷也能提供全面保護(hù)。因此，未來(lái)納米抗體可作為解毒劑以提供安全有效的治療方法。

 

3納米抗體在蛋白構(gòu)象研究中的應(yīng)用

 

蛋白質(zhì)作為與疾病相關(guān)的活性大分子，其表達(dá)或修飾的變化在疾病診斷研究方面發(fā)揮重要的作用，Nb已成為能將動(dòng)態(tài)蛋白凍結(jié)為單一功能構(gòu)型的精致工具，針對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定和其在細(xì)胞內(nèi)的定位，可以為眾多研究提供理論基礎(chǔ)。

 

3.1 VHH與蛋白分子融合

 

納米抗體的主要優(yōu)勢(shì)之一是可以將多個(gè)標(biāo)簽融合在其結(jié)構(gòu)中，例如His標(biāo)簽或綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)[85]，可以幫助我們了解蛋白質(zhì)在細(xì)胞或生物體內(nèi)的定位和功能[86]，融合復(fù)合物可作為靶向生物分子進(jìn)行疾病診斷治療或用于蛋白質(zhì)的定向失活等。靶向大腸桿菌F4菌毛的VHH域已被成功設(shè)計(jì)成具有強(qiáng)蛋白酶抗性和低pH值下的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了在胃腸道條件下仍能保持功能，Virdi等[87]研究出一種由VHH與IgA的Fc片段融合而成mVHH-IgA的口服抗體，經(jīng)過(guò)冷凍干燥或噴霧干燥等流程最終制備成飼料從而達(dá)到保護(hù)性治療的目的，可規(guī)?；a(chǎn)，進(jìn)而預(yù)防斷奶仔豬腹瀉相關(guān)的疾病F4-ETEC。

 

3.2 VHH 與蛋白分子靶向降解

 

與基因編輯和RNA干擾相比，直接在蛋白質(zhì)水平上操作生物分子的途徑對(duì)于蛋白質(zhì)功能研究更為有效，可以避免潛在的脫靶效應(yīng)等限制、克服基因失活的局限性和必需基因表型功能的喪失。為了實(shí)現(xiàn)感興趣的蛋白 (protein of interesting, POI) 的功能喪失和蛋白溶解，靶向蛋白降解是目前主要研究的一種策略，一種 Nb依賴型蛋白降解子可幫助實(shí)現(xiàn)POI快速降解及可逆調(diào)控，人們利用Nb不斷開發(fā)出各種誘導(dǎo)型降解子如生長(zhǎng)素、光或溫度依賴性方式降解的POI。

在生長(zhǎng)素依賴性納米抗體的研究中，Daniel 等通過(guò)對(duì)后期促進(jìn)復(fù)合物 / 環(huán)狀體(anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C) 一個(gè)亞基 ANAPC4 的研究，并結(jié)合生長(zhǎng)素和基于納米抗體降解技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，創(chuàng)造了一種植物激素誘導(dǎo)蛋白降解子 (auxin-inducible degron, AID)-納米抗體，可以靶向位于不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的 GFP 標(biāo)簽蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，證明了mAID-納米抗體可對(duì)內(nèi)源性GFP標(biāo)簽蛋白條件性和可逆性地失活，此外還通過(guò)建立 mAID-納米抗體在斑馬魚中的降解模型，進(jìn)一步將生長(zhǎng)素降解系統(tǒng)應(yīng)用于脊椎動(dòng)物模型生物中[88]。

VHH 在以GFP為目標(biāo)的降解技術(shù) (degrade green fluorescent protein, deGradFP) 中也得到了廣泛的應(yīng)用，Baudisch等在植物中使用一種特異性抗-GFP 納米抗體對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行靶向降解，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明納米抗體驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)定向降解也可以用于植物，這是deGradFP系統(tǒng)第一次被成功地應(yīng)用于煙草[89]。

 

3.3 VHH 與輔助蛋白結(jié)構(gòu)解析

 

獲得高分辨率下POI結(jié)構(gòu)解析一直是研究的熱點(diǎn)，Nb具有緊湊的單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，能夠以較高親和力結(jié)合靶蛋白，同時(shí)減少其構(gòu)象異質(zhì)性并穩(wěn)定多蛋白復(fù)合物，納米抗體衍生的巨型抗體 (megabodies) 在輔助單粒子冷凍電鏡 (single-particle cryo-EM) 下確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面展示了其優(yōu)勢(shì)，Uchański等[90]通過(guò)將納米抗體嫁接到選定的支架蛋白質(zhì)上以產(chǎn)生穩(wěn)定和有效折疊的單體嵌合體并開發(fā)了巨型抗體，這一研究有助于克服cryo-EM重建的分辨率顆粒大小和在水-空氣界面的優(yōu)先取向問(wèn)題，能夠獲得具有高分辨率下的cryo-EM譜圖，還能用于獲得那些通常遭受嚴(yán)重的優(yōu)先取向或由于太小而無(wú)法進(jìn)行精確的顆粒排列的膜蛋白的三維重建。通過(guò)對(duì)極有價(jià)值靶標(biāo) (如真核生物膜蛋白) 的高分辨率結(jié)構(gòu)分析，巨型抗體技術(shù)有潛力進(jìn)一步促進(jìn)單粒子冷凍電鏡多領(lǐng)域研究的迅速發(fā)展。

 

4小結(jié)及展望

 

納米抗體不僅能在基礎(chǔ)生物研究和醫(yī)療領(lǐng)域大放異彩，如創(chuàng)新的熒光納米探針可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞及蛋白結(jié)構(gòu)解析和動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)的細(xì)胞分析和可視化，觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行治療等，而且能夠在農(nóng)業(yè)如農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)、土壤污染檢測(cè)及修復(fù)等方面展現(xiàn)出更廣闊的研究潛力。

隨著研究的不斷深入，Nb優(yōu)越的特性也將會(huì)在更多領(lǐng)域展現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值：其高穩(wěn)定性或可使其在醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用中發(fā)揮作用，如解決疫苗或抗體藥物研發(fā)中存在的療效、安全性、費(fèi)用等一系列問(wèn)題及抗生素耐藥性的問(wèn)題，或能實(shí)現(xiàn)多途徑給藥；另外Nb在生物和農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的安全化生產(chǎn)并減少經(jīng)濟(jì)損失；此外，Nb或可在材料研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。寧夏具備獨(dú)厚的駱駝資源，本課題組已經(jīng)成功建立了抗牛結(jié)核分枝桿菌VHH抗體庫(kù)，所以未來(lái)可能會(huì)在動(dòng)物疫病防控方面致力于尋求一種能夠替代抗生素治療的納米抗體，并希望能通過(guò)飼料喂養(yǎng)或注射的方式達(dá)到預(yù)防及治療動(dòng)物相關(guān)疾病的目的。當(dāng)然我們期待未來(lái)Nb更多引人注目的研究成果的問(wèn)世。