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核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長 260 nm。

每種核酸的分子構(gòu)成不一， 因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算， 從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。

然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器， 表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。事實上，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和精確度。另外， 還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH 值、離子濃度等。在測試時，離子濃度太高也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH 值一定、離子濃度較低的緩沖液（如TE）可大大穩(wěn)定讀數(shù)。

樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。

最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低， 甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260 / A280的比值， 用于評估樣品的純度， 因為蛋白的吸收峰是280 nm。純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品的A320一般是 0。

各波長具體含義及相關(guān)問題

1．A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為0.1至1.0。如果不在此范圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此范圍內(nèi)；如果吸光度小于0.05，檢查是否存在操作因素（如移液不準確，樣品內(nèi)有懸浮物等）影響。

朗伯－比爾定律：

A 吸光值

I0 入射光強度

I 投射光強度

c 吸光物質(zhì)的摩爾濃度（mol/L）

d 光通過的液層厚度（cm）

ε 摩爾吸光系數(shù)（Lmol-1cm-1）

2．A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當于50％蛋白質(zhì)/DNA溶液

3．A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。

4．A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。如果不是，標明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。

5．核酸的吸光值受pH值和緩沖液離子濃度影響。只有在一定的pH值和低離子濃度的條件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精確的檢測結(jié)果。水的pH值不穩(wěn)定，可能導致檢測誤差。一些緩沖液在紫外范圍內(nèi)存在自身吸收，為了確保準確測量，請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩沖液。

6．在DNA樣品的測定中，一些平行測定的樣品會表現(xiàn)出測定濃度的變化，其可能原因為：①DNA樣品的A260 吸光度值是否>0.1。（請注意，這個值跟儀器無關(guān)，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）；②待測樣品是否經(jīng)過了充分的混勻，這樣才能保證測定值的均一；③待測樣品中有相當含量的雜質(zhì)。A260/A280和A260/A230是DNA純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應(yīng)該在2.0 或2.5，A230是多肽、芳香基團、苯酚和一些碳氫化合物的吸光度，A280是蛋白質(zhì)的吸光度。

7．A230產(chǎn)生負值主要是由于在很低DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負值會被校正。同時需要注意的是A260 的讀數(shù)也必需大于0.1 才能保證可靠的結(jié)果。