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高效液相色譜法（HPLC）是藥物開發(fā)和質(zhì)量控制過程的重要檢測手段。本文闡述了HPLC方法開發(fā)的一般流程。

 

1 概述

 

HPLC方法開發(fā)是理論和實(shí)踐的結(jié)合。在掌握HPLC的相關(guān)基礎(chǔ)知識的同時，了解HPLC系統(tǒng)中的各個變量對分析結(jié)果的影響才能更好地選擇色譜條件?；谝延行畔⒑徒?jīng)驗(yàn)，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)，并根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)逐漸優(yōu)化色譜條件，才能最終確定合適的HPLC檢測。

HPLC方法開發(fā)的步驟應(yīng)考慮如下內(nèi)容：

a)      信息調(diào)研：通過文獻(xiàn)或其他來源，收集原料藥的相關(guān)信息

b)     溶解度研究：確定溶解度情況和最大吸收波長

c)      色譜條件選擇：根據(jù)溶解度研究結(jié)果、化合物的保留時間等信息確定色譜柱、流動性、進(jìn)樣樣品

d)     進(jìn)行初步的HPLC分析檢測，最初階段的HPLC測試傾向采用的參數(shù)見表1。

e)      確定梯度或等度模式

f)      優(yōu)化色譜條件提高分離度：通過改變流動性組成、緩沖鹽、pH、色譜柱、流速、溫度等實(shí)現(xiàn)合適的分離度

g)     進(jìn)行原料藥的強(qiáng)降解試驗(yàn)確定方法的適用性

h)     確定系統(tǒng)適用性參數(shù)

i)       方法總結(jié)并完成開發(fā)報告

j)       進(jìn)行方法驗(yàn)證

 

表1.最初階段的HPLC分析測試傾向選擇的參數(shù)

 

 

2 方法開發(fā)過程中考慮要點(diǎn)

 

一個完整的HPLC檢測方法，應(yīng)當(dāng)包括樣品配制，分析檢測和最終的圖譜分析全過程的必要信息，而不只是與色譜條件相關(guān)的信息。然而，色譜條件的確定卻是方法開發(fā)最為重要的內(nèi)容。

 

2.1 信息調(diào)研

 

全面收集相關(guān)化合物的信息能夠?yàn)镠PLC方法開發(fā)提供更好支撐。尤其是很多仿制藥開發(fā)而言，化合物的公開信息眾多。一般的信息來源途徑包括審評文件、公開文獻(xiàn)和仿制藥手冊。甚至在某些時候，能夠直接找到已有的檢測方法。對于全新的化合物，以化合物類型搜索相關(guān)的支撐信息往往也能夠縮短方法開發(fā)的時間。例如，多肽類，苯環(huán)上位置異構(gòu)等在方法開發(fā)時存在一些通用性質(zhì)的理論和經(jīng)驗(yàn)。

 

2.2 溶解度研究

 

HPLC方法開發(fā)過程中的溶解度研究一般是評估原料藥在在水、緩沖液、氫氧化鈉、甲醇、乙腈、氯仿、己烷、四氫呋喃等多種水和有機(jī)溶劑中的溶解度。需要注意的是，由于樣品檢測過程中可能存在溫度波動，除去考察室溫環(huán)境下的溶解情況，也需要關(guān)注不同溫度下的溶解情況。一般而言，原料藥在所選稀釋劑中應(yīng)具有良好的溶解性（最好為1mg/ml），根據(jù)溶解度選定合適的溶劑。在所選溶劑中進(jìn)一步進(jìn)行光譜掃描，一般選擇200-400nm范圍，以確定藥物的光譜特征。

 

2.3 樣品稀釋劑（溶劑）的選擇

 

樣品所選用的稀釋劑（溶劑）應(yīng)適合所選的方法及預(yù)期的目的。常見的溶解的物理性質(zhì)見表1。對其主要要求如下：

a)      能夠溶解主要分析物，穩(wěn)定性良好

b)     不干擾分析物響應(yīng)

c)      防止分析物與容器表面的相互作用

 

表1. 常見溶劑的物理性質(zhì)

 

 

確定好溶劑之后，需要進(jìn)一步明確合適的樣品制備方法。對于制劑樣品常常需要開發(fā)針對主要分析物的提取方法。但是一般而言，方法開發(fā)早期都是僅僅針對化合物進(jìn)行的，在方法確定之后可以根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行方法優(yōu)化或補(bǔ)充。

 

2.4 波長選擇

 

波長選擇是方法開發(fā)的關(guān)鍵步驟。為了選擇波長，應(yīng)采用所選溶劑制備合適濃度的溶液，并在紫外分光光度計(jì)上掃描。在紫外掃描的基礎(chǔ)上，將供試品溶液注入配備光電二極管陣列檢測器的HPLC系統(tǒng)，并采集光譜。一般情況下，應(yīng)當(dāng)選擇能夠最佳響應(yīng)的波長用于藥物分析。但在某些時候，出于某些原因，例如避免干擾，也可以選擇其他波長。

 

2.5 色譜系統(tǒng)

 

正向色譜和反向色譜是目前最為常用的兩種色譜，根據(jù)不同的化合物性質(zhì)可以選擇合適的色譜系統(tǒng)。

 

2.5.1 正相色譜法

 

正相色譜的固定性極性大于流動相，一般情況下極性越強(qiáng)的化合物與固定相的相互作用越強(qiáng)，保留時間越長。如果出現(xiàn)以下情況，則首選正相色譜法：

a)      樣品溶解在非極性溶劑中，如己烷、氯仿、二氯甲基乙烷等（如果使用反相柱，直接進(jìn)樣可能存在問題）。

b)     反相色譜柱對樣品的保留能力得太強(qiáng)，即使是100%的有機(jī)相，50-60分鐘內(nèi)仍然沒有峰。

c)      反相色譜柱對樣品沒有保留能力。

d)     在分離過程中，反相色譜法無法獲得足夠的峰分離度。

e)      樣品由位置異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體和立體異構(gòu)體組成。

f)      對于在水相中會分解的化合物，正向色譜很有用。

正向色譜可以分析脂質(zhì)、糖、甾體、異構(gòu)體和多核芳烴等。對于正相HPLC，初始階段的嘗試實(shí)驗(yàn)可使用100%強(qiáng)溶劑，例如采用氰基柱（250 * 4.5μm，5μ）時，可以采用100%的異丙醇作為流動性，可以洗脫分離確定出所有0.5＜K＜20的成分。同樣地，也可以采用100%IPA的流動性以評估是否需要進(jìn)行梯度洗脫。為了改變強(qiáng)溶劑的選擇性，可以用氯甲烷、MTBE（甲基-1-丁基醚）、乙腈或乙酸乙酯等替代異丙醇。但是，溶劑的選擇往往取決于檢測器類型。

對于正向色譜，一些常用的固定相按照分離效果遞減的順序?yàn)榍杌?gt;二氧化硅>二醇>氨基等，可以根據(jù)需求進(jìn)行選擇。對于堿性和酸性化合物，可以在流動相中添加三乙胺和乙酸，以防止拖尾。

 

2.5.2 反相色譜法

 

高效液相色譜法的首選應(yīng)該是反相色譜法，化合物的分離取決于具有不同程度親疏水性的固體相對溶質(zhì)分子的可逆解吸/吸附。其固定性極性小于流動相，一般情況下極性越高的化合物保留時間越短。根據(jù)原料藥的性質(zhì)（酸性/堿性/中性）選擇適合的條件，可以采用合適的梯度洗脫方式進(jìn)行HPLC檢測的首次嘗試。為了進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，應(yīng)當(dāng)對首次檢測的色譜圖進(jìn)行仔細(xì)分析。根據(jù)分析結(jié)果，可以通過改變流動相組成、緩沖液pH值、柱填料、柱溫度、流速等，以獲得最佳分離條件。確立了初步的色譜條件后，應(yīng)當(dāng)再多次進(jìn)樣分析，經(jīng)過多次檢測確認(rèn)可重復(fù)性，最終獲得適當(dāng)?shù)姆蛛x條件，再進(jìn)行進(jìn)一步的條件優(yōu)化。

 

2.5.3 等度或梯度模式的選擇

 

液相色譜檢測中，若流動性的組成比例保持不變，稱為等度洗脫，若流動性的比例逐漸改變，則稱為梯度洗脫。梯度洗脫可能會縮短分析周期、提高分離能力。

等度模式和梯度模式的設(shè)計(jì)的條件基本相同。在初始階段，應(yīng)當(dāng)是一段空白梯度，這可以用來檢查基線噪聲。在末尾階段應(yīng)當(dāng)是一段空白梯度，與初始的流動性比例一致。

為了確定樣品應(yīng)當(dāng)采用梯度還是等度，可以參考參考文獻(xiàn)【1】中的方法。首先采用5~100%乙腈-緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為2.0 ml/min，持續(xù)60 min，據(jù)此估算強(qiáng)溶劑的最佳初始和最終百分比?？梢灾貜?fù)運(yùn)行幾次以確認(rèn)分離的再現(xiàn)性。計(jì)算總梯度運(yùn)行時間與第一個和最后一個組分的梯度時間之差之間的比率。如果比率為?0.25，則應(yīng)選擇等度模式，如果比率?0.25，選擇梯度模式則更好。

 

2.5.4 反相離子對色譜法

 

如果反相色譜中不能實(shí)現(xiàn)足夠的分離度，則使用離子對試劑是非常有用的。RP-HPLC和離子配對RP-HPLC的唯一區(qū)別是在流動相中加入離子對試劑，以提高離子樣品的選擇性。然而，除非有明確的支撐信息，應(yīng)當(dāng)首先反向色譜，然后才是反向離子對色譜。流動相的有機(jī)溶劑會影響離子對試劑的溶解度，最好使用甲醇，而不是乙腈和四氫呋喃。在反相離子對色譜中，緩沖液的濃度應(yīng)為25mm左右。流動相pH值與離子對直接相關(guān)，離子對帶負(fù)電還是帶正電，取決于分析液是堿還是酸。對于堿或陽離子樣品，可選擇戊烷/己烷或更高碳?xì)浠衔锘撬猁}離子對試劑，對于酸或陰離子樣品，可使用四乙基氫氧化銨作為離子對試劑。

 

2.6 方法開發(fā)參數(shù)的優(yōu)化

 

2.6.1 緩沖溶液的選擇

 

特定pH值的流動相可實(shí)現(xiàn)酸性或堿性成分的有效分離。緩沖鹽溶液應(yīng)無紫外吸收，或緩沖鹽溶液的紫外吸收波長應(yīng)小于有機(jī)溶劑的波長。此外，還應(yīng)考慮其他條件，如穩(wěn)定性、溶解度和與分析物的反應(yīng)性。緩沖溶液的容量可以用pH值、緩沖液的組成和緩沖液的濃度來評估。pH值等于緩沖液的pKa可提供最佳緩沖容量。大多數(shù)緩沖液都有足夠的緩沖容量，可將流動相pH值控制在pKa±1左右。C8-或C18-鍵合硅膠基固定相HPLC柱通常用于反相色譜，一般而言，它們在2~8的pH范圍之外，穩(wěn)定性較差。因此，應(yīng)當(dāng)選擇可以將pH值控制在2~8范圍內(nèi)的緩沖鹽體系。當(dāng)然有些色譜柱的pH耐受范圍更寬或更窄，遵照其說明書使用即可。

 

2.6.2 緩沖液pH值的選擇

 

對于不同pKa的化合物，其保留時間隨流動相的pH改變而改變。酸性化合物的保留時間隨pH降低而延長，堿性化合物則相反。為確?；衔锾幱?00%非離子狀態(tài)，流動性的pH值至少高于或低于pKa 1.5個pH單位，這有利于實(shí)現(xiàn)分離。較低的pH值（1–4）有利于減小峰拖尾和提高的耐用性。相比之下，中等pH范圍（4–8）則能提高選擇性和提供更好的保留時間。表2中列出了用于HPLC分離的不同緩沖液。

 

表2. HPLC中常用的緩沖鹽

 

 

2.6.3 流動相選擇

 

流動相組成的優(yōu)化是高效液相色譜分析的關(guān)鍵部分。一般情況，所選流動性沸點(diǎn)應(yīng)高于柱溫20~50℃，但低于100℃，粘度不大于5*10-4Pa s。在所有的有機(jī)溶劑中，乙腈和甲醇是RP-HPLC中最為常用的有機(jī)溶劑。接下來是四氫呋喃，但四氫呋喃流動相易被氧化，其使用范圍較小。在實(shí)際的優(yōu)化過程中，通常需要采用不同有機(jī)相和不同pH值的緩沖溶液作為流動相進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果確定最終的流行相以實(shí)現(xiàn)樣品中各個組分的最佳分離。對于反向色譜，流動相中有機(jī)相的比例增加，保留時間會縮短，但可能導(dǎo)致峰的分離程度不夠。如果在流動相中使用100%有機(jī)溶劑后沒有分離，則應(yīng)降低溶劑強(qiáng)度以獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ?。在多組分分離（許多物質(zhì)/分子/混合物）且分辨率較弱的情況下，應(yīng)嘗試不同極性指數(shù)的有機(jī)溶劑，甚至兩種或兩種以上有機(jī)溶劑的組合，以獲得有效分離。溶劑選擇可以進(jìn)一步參見參考文獻(xiàn)【2】中的內(nèi)容。

 

2.6.4 色譜柱選擇

 

色譜柱是高效液相色譜系統(tǒng)的重要組成部分，在分析中起著至關(guān)重要的作用。為HPLC方法選擇色譜柱時應(yīng)考慮的參數(shù)包括：柱填料、顆粒的大小和形狀、柱的長度和直徑、碳負(fù)荷百分比、孔隙體積、端蓋。對于反相色譜，可使用多種色譜柱，如C8、C18、氰基類–CN和氨基類–NH2等。沒有兩種色譜柱完全相同，不同供應(yīng)商的色譜柱可能在上述參數(shù)方面有所差異。不用色譜柱的主要差異是鍵合相載體的表面積，因?yàn)檩^大的表面積賦予較大的保留能力（C18>C8>C3>C1）。為了確定方法中的色譜柱類型，應(yīng)使用不同色譜柱采用不同的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以獲得最佳分離效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇的色譜柱應(yīng)能將主峰與所有已知雜質(zhì)分離，并能適應(yīng)流動相的變化。色譜柱的類型多樣，根據(jù)不同的化合物性質(zhì)可以進(jìn)行選擇，進(jìn)一步參見參考文獻(xiàn)【3】中的內(nèi)容。

 

2.6.5 柱溫選擇

 

通常，最好在溫和的溫度環(huán)境下優(yōu)化色譜條件，但是如果在室溫下，選擇不同的色譜柱或不同流動相的任何組合也無法實(shí)現(xiàn)峰對稱性，則可以考慮采用高于環(huán)境溫度的柱溫度。如果柱溫升高，峰對稱性和峰保留時間降低，但溫度變化會改變離子化化合物的pH值和pKa值，可能會實(shí)現(xiàn)離子化合物更好地分離。

 

2.6.6 試驗(yàn)濃度和注射量的選擇

 

試驗(yàn)濃度的選擇取決于API在選定波長下的響應(yīng)。通常進(jìn)樣的化合物量應(yīng)當(dāng)小于100μg。如果樣品需要進(jìn)行配制，需要明確配制過程中分析物沒有損失。通常，建議進(jìn)樣量為10~20μl，但根據(jù)需求（例如樣品濃度過低，樣品響應(yīng)過低），可將進(jìn)樣量增加至50–100μl。在選擇高進(jìn)樣量之前，應(yīng)確保在選擇較高進(jìn)樣量時，色譜柱不會過載，且分辨率和峰對稱性不會受到影響。

 

2.6.7 過濾器相容性

 

如果樣品在進(jìn)樣前需要采用濾膜過濾，應(yīng)當(dāng)選擇合適的濾膜，并檢查濾膜對藥物的吸附情況。首先，所需的濾膜應(yīng)當(dāng)與樣品的溶劑相容性良好。在進(jìn)行吸附性考察時，在稀釋劑中制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，并使用幾種種不同類型的濾膜進(jìn)行過濾。過濾標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)果應(yīng)與未過濾標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)果進(jìn)行比較，過濾部分的結(jié)果應(yīng)在未過濾標(biāo)準(zhǔn)溶液和離心/未過濾樣品溶液的±2.0%范圍內(nèi)。

 

3 總結(jié)

 

HPLC的方法開發(fā)是一個漸進(jìn)的過程，并伴隨藥物開發(fā)過程不斷優(yōu)化，同時根據(jù)不同的分析需求，參數(shù)也可能進(jìn)行調(diào)整。通常，在完成初步的方法開發(fā)后，可以考慮進(jìn)行強(qiáng)降解試驗(yàn)確檢測方法的分離效果和適用性。伴隨原料藥工藝的優(yōu)化、制劑處方工藝的變化，穩(wěn)定性考察的新增雜質(zhì)等因素，HPLC方法也需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

 

參考文獻(xiàn)

 

（1）紛繁，等度洗脫和梯度洗脫的選擇及條件計(jì)，https://www.bzwz.com/bbs/topic_1628_1.html；

（2）萬事皆空，高效液相色譜溶劑的選擇，藥事縱橫；

（3）藥事一刻，高效液相色譜柱的選擇；藥事縱橫；

（4）MukeshMaithani, Development of Novel Stability Indicating Methods Using LiquidChromatography, 1.6 General Considerations for HPLC Method development.