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在植物檢測(cè)中，蝦青素屬于常見(jiàn)的植物色素種類(lèi)之一。由于擁有比β-胡蘿卜的素更強(qiáng)的抗氧化能力，所以蝦青素常用于保健品、食品添加劑、飼料添加劑、醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品生產(chǎn)。商業(yè)化生產(chǎn)的蝦青素分為人工化學(xué)合成和天然生物合成兩大類(lèi)。目前商業(yè)化的蝦青素主要來(lái)源于藻類(lèi)和微生物、甲殼動(dòng)物的殼，提取方式通過(guò)真菌發(fā)酵或粉碎提取，比如含量較高的雨生紅球藻和紅法夫酵母應(yīng)用就比較廣泛。

一、需求背景

蘇州某生物科技公司，想要檢測(cè)的一款蝦青素產(chǎn)品，尤其是光異構(gòu)體的含量。由于今年來(lái)雨生紅球藻行業(yè)催生的蝦青素市場(chǎng)得到廣泛發(fā)展，所以市場(chǎng)上相關(guān)產(chǎn)品良莠不齊、以次充好現(xiàn)象也是客觀存在的。用人工合成蝦青素或者紅法夫酵母酵母蝦青素冒充雨生紅球藻蝦青素銷(xiāo)售使用的原料，一旦被應(yīng)用到實(shí)際產(chǎn)品中，結(jié)果都可能是災(zāi)難性的。蝦青素含量測(cè)定已經(jīng)不能滿(mǎn)足當(dāng)前的技術(shù)要求，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性定量也成為檢測(cè)的重要一環(huán)。

蝦青素基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由四個(gè)異戊二烯單位以共軛雙鍵形式相連接，兩邊是兩個(gè)含氧的六元環(huán)，且羥基處于羰基的α位，構(gòu)成了α羥基酮的結(jié)構(gòu)。由于蝦青素有2個(gè)手性中心，在3-和3’-位，因此有三種旋光異構(gòu)體，分別是3S,3’S（左旋）；3R,3’S（內(nèi)消旋）和3R,3’R（右旋）。而如果是合成蝦青素，則由3S,3’S（左旋）；3R,3’S（內(nèi)消旋）和3R,3’R（右旋）三種旋光異構(gòu)體按接近1:2:1的比率組成，一直以來(lái)作為紅色著色劑應(yīng)用于動(dòng)物著色。天然來(lái)源的蝦青素則不同物種存在不同旋光異構(gòu)體組成和比例，其中紅法夫酵母發(fā)酵蝦青素為3R,3’R（右旋）結(jié)構(gòu)，，雨生紅球藻作為3S,3’S（左旋）結(jié)構(gòu)。因此我們可以通過(guò)檢測(cè)蝦青素的旋光異構(gòu)體含量進(jìn)行定性定量分析。

二、檢測(cè)方法確定

蝦青素的檢測(cè)方法主要有分光光度法和高效液相法。分光光度法主要是利用蝦青素的最高吸收峰為478，因此在波長(zhǎng)為 478下進(jìn)行比色即可測(cè)定蝦青素的含量。由于該種方法比較簡(jiǎn)單，可能存在的誤差也較大，所以高效液相色譜法是檢測(cè)蝦青素的主流方法。比如，GB/T 31520-2015就規(guī)定了用液相色譜法檢測(cè)紅球藻中蝦青素。雖然GB/T 31520-2015規(guī)定了蝦青素含量的檢測(cè)方法，但是蝦青素的光異構(gòu)體含量卻沒(méi)有提出，所以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38478-2021專(zhuān)門(mén)針對(duì)光異構(gòu)體含量檢測(cè)給出了一套解決方案。所以我們決定已經(jīng)GB/T 38478-2021采用液相色譜法進(jìn)行測(cè)試。

三、試驗(yàn)步驟

1.樣品制備

蝦青素樣品的提取方法要根據(jù)具體類(lèi)型進(jìn)行選擇，比如固體類(lèi)、油劑類(lèi)和水溶液類(lèi)試樣的提取方法都是不一樣的。

該生物科技公司的樣品為固體試樣，所以我們對(duì)樣品進(jìn)行如下制備：稱(chēng)取50.0mg~100.0mg置于干燥的20mL玻璃勻漿器中，加入2mL丙酮，充分研磨使樣品破碎完全，轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，用5mL丙酮溶液分三次清洗玻璃勻漿器，合并提取液，5℃下3800r/min離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，離心管管中加入2mL丙酮溶液。重復(fù)上述步驟3次以上，直至提取后的渣呈灰白色，合并上清液，用丙酮溶液定容至50mL，供測(cè)。

注：蝦青素含量高于2%的試樣的稱(chēng)樣量不大于50mg。

2.測(cè)試溶液制備

移取2.0mL皂化后的溶液至10mL玻璃離心管中，往管中加入1g的十水硫酸鈉，2mL石油醚后劇烈震蕩30次或渦旋混合30秒后，然后避光冰水浴中靜置或置于離心機(jī)中3000rmp下離心3min，溶液出現(xiàn)明顯分層，色素被轉(zhuǎn)移至上層石油醚中，用移液管小心地將石油醚層轉(zhuǎn)移至新的10mL玻璃離心管中，氮?dú)獯蹈墒兔眩尤?.0mL乙腈超聲溶解，得到的溶液即為供試品溶液。

3.色譜條件

色譜柱：IC 多糖衍生物共價(jià)鍵合手性柱， 4.6 mm×250 mm， 5µm， 或相當(dāng)者。

柱溫：25℃。

紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng) 470 nm。

進(jìn)樣量：20 µL。

流速：1.0 mL/min。

流動(dòng)相:甲基叔丁基醚+乙腈=35+65。

3.定性定量

旋光異構(gòu)體組成成分是蝦青素制品重要的指標(biāo)， 該指標(biāo)主要考核不同來(lái)源的含蝦青素產(chǎn)品。由于蝦青素?fù)碛凶笮?內(nèi)消旋和右旋三種不同的旋光異構(gòu)體， 其中雨生紅球藻來(lái)源的全部是左旋結(jié)構(gòu)， 紅法夫酵母來(lái)源的是右旋結(jié)構(gòu)， 而人工合成的蝦青素為三種旋光異構(gòu)體的混合物（其左旋：內(nèi)消旋：右旋為 1:2:1） ， 而不同旋光異構(gòu)體的生物活性和安全性不盡相同， 需要對(duì)產(chǎn)品中的蝦青素旋光異構(gòu)體組成成分進(jìn)行鑒定。檢測(cè)方法就是，分別注入 20 µL 適當(dāng)濃度的左旋蝦青素的對(duì)照品溶液， 人工合成蝦青素對(duì)照品溶液， 右旋蝦青素的對(duì)照品溶液， 供試品溶液， 按下圖中列出的色譜條件進(jìn)行液相色譜分析測(cè)定， 根據(jù)對(duì)照品溶液色譜中的蝦青素同分異構(gòu)體的保留時(shí)間定性對(duì)照品色譜圖

考慮到操作的簡(jiǎn)便性和經(jīng)濟(jì)性， 蝦青素旋光異構(gòu)體的定量計(jì)算， 首先使用由國(guó)標(biāo) GB/T31520-2015 法測(cè)得的蝦青素總量， 再與其中具體的某種蝦青素旋光異構(gòu)體所占比例相乘， 所獲得的乘積作為最后的某種蝦青素旋光異構(gòu)體的含量。

四、總結(jié)

我們通過(guò)對(duì)蝦青素旋光異構(gòu)體進(jìn)行測(cè)定，可以準(zhǔn)確判斷蝦青素產(chǎn)品的來(lái)源，從而為蝦青素生產(chǎn)企業(yè)提供產(chǎn)品質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督的重要參考數(shù)據(jù)。當(dāng)然，對(duì)于選光異構(gòu)體定性定量也可以幫助我們尋找高效合適的物理和化學(xué)脅迫因子，在不對(duì)藻細(xì)胞致死或?qū)⒅滤懒靠刂圃谝欢ǚ秶鷥?nèi)的前提下，脅迫藻細(xì)胞盡量產(chǎn)生更多的蝦青素；如果是紅法夫酵母，我們可以通過(guò)研究其培養(yǎng)基的成分來(lái)存進(jìn)蝦青素的合成。