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 2021年，PDA發(fā)布了技術(shù)報(bào)告60-3：工藝驗(yàn)證、生命周期的方法，附件2生物制藥原液的生產(chǎn)，其中提高層析介質(zhì)的相關(guān)驗(yàn)證是工藝驗(yàn)證的重要一部分。層析介質(zhì)需要證明其在生命周期內(nèi)保持一致性的能力，需要評(píng)估層析介質(zhì)的清潔程序的有效性以及清潔程序?qū)游鼋橘|(zhì)壽命的影響，更重要的是，該報(bào)告還提出層析介質(zhì)需要驗(yàn)證能夠保持其性能所需要的保存時(shí)間和保存條件的驗(yàn)證，而這是行業(yè)大多數(shù)企業(yè)常忽略的一點(diǎn)。

 

為了更好地滿(mǎn)足監(jiān)管機(jī)構(gòu)的期望以及行業(yè)企業(yè)更好地進(jìn)行層析介質(zhì)相關(guān)驗(yàn)證的實(shí)踐，本文提出了一種層析介質(zhì)壽命、清潔和保存驗(yàn)證的綜合設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)綜合利用了縮小模型和商業(yè)化規(guī)模運(yùn)行，前瞻性工藝驗(yàn)證與持續(xù)工藝驗(yàn)證，并且完全符合法規(guī)對(duì)層析介質(zhì)驗(yàn)證的期望。

 

層析介質(zhì)的壽命、清潔和保存驗(yàn)證的綜合設(shè)計(jì)主要包括以下步驟：

 

● 步驟1：層析介質(zhì)清潔程序的開(kāi)發(fā)

 

● 步驟2：層析介質(zhì)縮小模型的壽命和清潔驗(yàn)證

 

● 步驟3：層析介質(zhì)商業(yè)化規(guī)模的清潔確認(rèn)

 

● 步驟4：層析介質(zhì)壽命和清潔的持續(xù)確認(rèn)

 

● 步驟5：層析介質(zhì)的保存驗(yàn)證

 

步驟1

 

層析介質(zhì)清潔程序的開(kāi)發(fā)

 

 層析介質(zhì)的清潔程序本應(yīng)是層析純化工藝固有的一部分。特定的層析純化必須要包含特定的層析介質(zhì)清潔程序。

 

清潔程序的開(kāi)發(fā)需要考慮層析過(guò)程中的污染物、清潔試劑的選擇以及清潔工藝參數(shù)的研究。清潔工藝參數(shù)應(yīng)像開(kāi)發(fā)層析分離工藝參數(shù)一樣進(jìn)行研究，必要時(shí)可采用FMEA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和縮小模型進(jìn)行DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以便確定清潔工藝參數(shù)之間的交互作用和設(shè)計(jì)空間。

 

最后，清潔程序需要放大，應(yīng)在大規(guī)模的生產(chǎn)工藝中建立最終的清潔工藝操作和性能參數(shù)的操作范圍，并且要符合GMP的要求。

 

 

圖1. 親和層析填料Mabselect SuRe的清潔程序的設(shè)計(jì)空間示意圖。

 

步驟2

 

層析介質(zhì)縮小模型的壽命和清潔驗(yàn)證

 

該步驟是在縮小模型同時(shí)進(jìn)行層析介質(zhì)的壽命和清潔驗(yàn)證，目的一是驗(yàn)證層析介質(zhì)的可重復(fù)使用次數(shù)，二是同時(shí)驗(yàn)證清潔程序?qū)勖挠绊懸约扒鍧嵆绦驅(qū)埩粑锢鄯e效應(yīng)的控制。

 

該驗(yàn)證的操作方法是首先建立層析步驟的縮小模型，同時(shí)對(duì)縮小模型進(jìn)行確認(rèn)，以保證能夠代表大規(guī)模的層析操作；然后設(shè)計(jì)層析介質(zhì)的壽命驗(yàn)證，在壽命驗(yàn)證的同時(shí)，適時(shí)進(jìn)行模擬運(yùn)行，驗(yàn)證清潔程序的有效性。

 

案例：

 

本案例設(shè)計(jì)層析介質(zhì)縮小模型的壽命驗(yàn)證，共進(jìn)行121個(gè)循環(huán)，每隔10個(gè)循環(huán)的收集樣品進(jìn)行全部檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)。

 

同時(shí)在壽命驗(yàn)證期間周期性的進(jìn)行了模擬運(yùn)行，模擬運(yùn)行是每隔10個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次。模擬運(yùn)行的洗脫收集液檢測(cè)HCP和HCD，以及使用銀染SDS-PAGE檢測(cè)總蛋白雜質(zhì)的殘留。

 

表1：層析介質(zhì)壽命驗(yàn)證部分結(jié)果數(shù)據(jù)

 

 

表2：模擬運(yùn)行結(jié)果數(shù)據(jù)

 

 

步驟3

 

層析介質(zhì)商業(yè)化規(guī)模的清潔確認(rèn)

 

盡管在縮小規(guī)模上綜合設(shè)計(jì)了層析介質(zhì)的壽命和清潔驗(yàn)證，但是還是需要在商業(yè)化規(guī)模的層析柱上來(lái)驗(yàn)證層析介質(zhì)的使用壽命和清潔有效性。這可以伴隨著工藝性能確認(rèn)（PPQ）批次進(jìn)行。

 

PDA技術(shù)報(bào)告49，生物技術(shù)產(chǎn)品的清潔驗(yàn)證考慮要點(diǎn)，提到了商業(yè)化規(guī)模下進(jìn)行清潔驗(yàn)證的方法，其中適用于層析介質(zhì)商業(yè)化規(guī)模清潔驗(yàn)證的方法包括淋洗水法和模擬運(yùn)行方法。

 

案例：

 

該案例是一個(gè)CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，商業(yè)化規(guī)模為2000L。該案例的層析介質(zhì)清潔驗(yàn)證是伴隨三批次的工藝性能確認(rèn)（PPQ）進(jìn)行，采用模擬運(yùn)行的方法。

 

 表3

 

 

基于幾批次的原液生產(chǎn)，平均原液產(chǎn)量為2925g，即可計(jì)算該清潔工藝驗(yàn)證的殘留物為：

 

● 總蛋白殘留（BCA）：< 2.330mg/g

 

● 總HCP殘留：< 1.154ug/g

 

● 總DNA殘留：< 3.402ng/g

 

此外，SDS-PAGE銀染沒(méi)有檢測(cè)到任何蛋白帶，微生物限度和內(nèi)毒素也符合原液的批次放行結(jié)果。

 

最終，證明該清潔工藝在商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模上也具有很好的效果。

 

步驟4

 

層析介質(zhì)壽命和清潔的持續(xù)確認(rèn)

 

在產(chǎn)品獲批進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)之后，仍需要一個(gè)持續(xù)工藝確認(rèn)的方案來(lái)確認(rèn)在商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模上，層析介質(zhì)可一致的處于驗(yàn)證過(guò)的受控狀態(tài)，比如使用壽命、殘留物累積、病毒清除等。

 

對(duì)于層析介質(zhì)使用壽命，應(yīng)持續(xù)監(jiān)控在預(yù)估的使用壽命期間的層析步驟收率、工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的去除，以及該步驟相關(guān)的其他檢測(cè)指標(biāo)，以確認(rèn)層析介質(zhì)和純化工藝性能處于受控狀態(tài)。

 

對(duì)于層析介質(zhì)的清潔狀態(tài)，可通過(guò)持續(xù)的監(jiān)控清潔工藝參數(shù)，比如清潔劑濃度、接觸時(shí)間、清潔溫度等確認(rèn)清潔工藝處于受控狀態(tài)。也可進(jìn)行商業(yè)化規(guī)模的模擬運(yùn)行，比如每10個(gè)生產(chǎn)批次來(lái)持續(xù)確認(rèn)清潔工藝的有效性。

 

另外，還應(yīng)建立變更控制程序來(lái)維持層析介質(zhì)受控的驗(yàn)證狀態(tài)。

 

步驟5

 

層析介質(zhì)的保存驗(yàn)證

 

盡管層析介質(zhì)供應(yīng)商可以提供相應(yīng)層析介質(zhì)在其保存試劑條件下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)和加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，但是供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)不能代替層析介質(zhì)保存條件驗(yàn)證，因?yàn)楣?yīng)商的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)使用的是新填料，并且常規(guī)是散裝條件下的保存驗(yàn)證。

 

真正的生產(chǎn)過(guò)程中，層析介質(zhì)的保存有可能是拆裝后的散裝保存，也可能是直接在裝柱條件下的保存，另外，生產(chǎn)過(guò)程中的層析介質(zhì)保存時(shí)基本都是經(jīng)歷過(guò)生產(chǎn)使用過(guò)程。因此，進(jìn)行層析介質(zhì)的保存驗(yàn)證需要考慮這些實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程情況。

 

因此，無(wú)論進(jìn)行散裝條件還是裝柱條件下的保存驗(yàn)證，最好采用使用過(guò)的層析介質(zhì)，建議使用次數(shù)＞10次。

 

保存驗(yàn)證中選擇合適的保存容器、保存溶液和保存時(shí)限，在保存初始檢測(cè)層析介質(zhì)的微生物限度、內(nèi)毒素以及相應(yīng)的功能性檢測(cè)，包括但不限于粒徑分布、壓力流速、動(dòng)態(tài)結(jié)合載量等。保存到一定時(shí)限時(shí)，重復(fù)上述檢測(cè)，更換保存緩沖液，直至重復(fù)更換三次。

 

保存驗(yàn)證的結(jié)果可支持本公司使用相同層析介質(zhì)的多個(gè)產(chǎn)品項(xiàng)目。

 

總結(jié)

 

上述提出的層析介質(zhì)壽命、清潔和保存驗(yàn)證的綜合設(shè)計(jì)符合監(jiān)管期望，并且符合行業(yè)的常規(guī)操作。綜合利用了縮小模型與商業(yè)化規(guī)模，前瞻性驗(yàn)證與持續(xù)工藝驗(yàn)證的理念，是行業(yè)關(guān)于層析介質(zhì)相關(guān)驗(yàn)證的良好實(shí)踐。

 

同時(shí)，為了保證最終商業(yè)化生產(chǎn)的順利進(jìn)行，選擇合適的供應(yīng)商，并要求提供相應(yīng)的法規(guī)支持文件和更多的通用適用數(shù)據(jù)，是選擇層析介質(zhì)并能成功應(yīng)用的前提，這也是層析介質(zhì)相關(guān)驗(yàn)證中不得不考慮的一點(diǎn)。