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我國體外診斷產(chǎn)業(yè)正處于蓬勃發(fā)展的階段，積累了一定的技術(shù)基礎(chǔ)，但尚存在產(chǎn)品設(shè)計開發(fā)過程不規(guī)范等問題。如何在符合我國國情的前提下，指導(dǎo)企業(yè)科學(xué)合理的開展體外診斷試劑的設(shè)計和開發(fā)成為亟待解決的問題。這就要求企業(yè)不僅應(yīng)重視臨床性能的評價，也需系統(tǒng)而全面地進(jìn)行分析性能的研究，以綜合評價產(chǎn)品的安全有效性;其中關(guān)鍵的項目之一為定性檢測試劑的陽性判斷值或定量檢測試劑的參考區(qū)間。正確的建立體外診斷試劑的陽性判斷值或參考區(qū)間會大幅提高臨床評價指標(biāo)滿足驗收標(biāo)準(zhǔn)的概率，反之可能對臨床試驗結(jié)果（如靈敏度和特異性）造成不利影響。

1、陽性判斷值或參考區(qū)間確定的總體要求

體外診斷試劑的陽性判斷值或參考區(qū)間研究是臨床前研究的重要組成部分之一。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)在主要原材料和生產(chǎn)工藝經(jīng)過選擇和確認(rèn)、質(zhì)量管理體系得到有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，制訂方案并相應(yīng)的開展研究。試驗人員應(yīng)經(jīng)過必要的培訓(xùn)，熟悉檢測系統(tǒng)的操作程序、樣本制備方式和試驗方案，嚴(yán)格執(zhí)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制方法,定期對設(shè)備進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)。建議使用多批產(chǎn)品，采用科學(xué)合理的試驗方法確定產(chǎn)品的陽性判斷值或參考區(qū)間。在對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)檢查后，選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法進(jìn)行檢驗或分析，并形成報告。樣本數(shù)量需符合統(tǒng)計學(xué)要求。

2、陽性判斷值或參考區(qū)間確定的方案和采用的樣本

2.1陽性判斷值或參考區(qū)間的特點

陽性判斷值或參考區(qū)間反映了體外診斷試劑區(qū)分受試者目標(biāo)狀態(tài)特征（如健康或疾病）的性能,在鑒別良性與惡性疾病、確定疾病進(jìn)程、監(jiān)測治療效果、判定預(yù)后情況、指導(dǎo)臨床處置或者影響醫(yī)療決策制定等方面具有重要意義。陽性判斷值或參考區(qū)間的正確制定能夠充分體現(xiàn)產(chǎn)品的臨床表現(xiàn)，如區(qū)分正常/異常的能力或診斷準(zhǔn)確性。

2.2陽性判斷值或參考區(qū)間確定的方案和采用的樣本

陽性判斷值或參考區(qū)間的確定過程包括建立與確認(rèn)兩個階段。建議區(qū)分訓(xùn)練集和驗證集，分別納入不同的樣本子集進(jìn)行研究。必要時應(yīng)考慮充分覆蓋不同亞群的樣本。注意納入研究的樣本應(yīng)來源于產(chǎn)品的適用人群以及相關(guān)適應(yīng)癥。注意應(yīng)采用臨床真實樣本進(jìn)行研究，明確樣本的來源、類型和背景信息（如年齡、性別、干擾因素等）；如檢測結(jié)果有明確的疾病指向，還應(yīng)包括臨床診斷信息。應(yīng)從預(yù)期適用人群中選擇具有代表性的目標(biāo)人群（如不同組織病理類型或分期的腫瘤、其他相關(guān)的良惡性疾病），并從臨床意義的角度考慮其中可能存在的亞群,對各個亞群檢測值的差值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，如存在顯著差異，則應(yīng)針對亞群分別建立參考區(qū)間（如不同種族、性別、年齡、目標(biāo)狀態(tài)）。必要時對不同亞群（如不同分期的肺癌患者）樣本分層進(jìn)行統(tǒng)計分析以確定各個亞群的陽性判斷值或參考區(qū)間?？删唧w比較不同臨床背景特征的適用人群，不同種族或地域人群,具有流行病學(xué)差異的人群以及不具有可比性的樣本類型之間的差異,必要時分別建立陽性判斷值或參考區(qū)間。

另外，建議充分考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標(biāo)人群的代表性，在臨床試驗階段進(jìn)一步確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。對于定量檢測試劑，如為具有相同的地理區(qū)域以及人口統(tǒng)計學(xué)特征（包括種族）的目標(biāo)人群，在方法學(xué)比較研究結(jié)果一致的前提下，可考慮轉(zhuǎn)移同類產(chǎn)品的參考區(qū)間。

3、陽性判斷值或參考區(qū)間確定推薦的研究方法

3.1定性檢測試劑

方法使用具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的受試者樣本，采用受試者工作特征曲線（ROC)的方法確定陽性判斷值。樣本來源應(yīng)為該檢測項目結(jié)果應(yīng)用的代表性人群，并參照臨床診斷信息或者對比方法的檢測結(jié)果進(jìn)行陰陽性判定。建議納入陰陽性比例相似的樣本進(jìn)行研究,無需選取反映實際發(fā)病率的樣本。在實際應(yīng)用中，還需考慮檢測結(jié)果與臨床進(jìn)程相關(guān)性的研究,不僅是與診斷結(jié)果一致性的研究。另外，建議申請人從臨床意義的角度出發(fā)，合理設(shè)定灰區(qū)范圍并詳細(xì)說明確定的依據(jù)。注意明確對于灰區(qū)結(jié)果的后續(xù)處理措施，如進(jìn)行復(fù)測后確認(rèn)或者其他試劑確認(rèn)等。

3.2定量檢測試劑

可根據(jù)數(shù)據(jù)的分布形式，采用非參數(shù)統(tǒng)計法或者參數(shù)統(tǒng)計法。方法可使用至少120個來自目標(biāo)人群的受試者樣本，采用非參數(shù)統(tǒng)計方法建立參考區(qū)間（如適用，包括90%或95%置信區(qū)間）。建議基于嚴(yán)格的人群人選標(biāo)準(zhǔn)，排除檢測項目潛在異常的人群，入選健康正常人樣本建立參考區(qū)間?？墒褂谜{(diào)查問卷評估各受試者的健康狀況。在實驗室、分析系統(tǒng)（方法和儀器）、地理區(qū)域或人群存在一個變量的情況下，可考慮轉(zhuǎn)移分析物的參考區(qū)間。轉(zhuǎn)移參考區(qū)間的方法可使用至少20個受試者樣本進(jìn)行評價，并在多于2個樣本超出參考區(qū)間范圍的情況下納入更多的樣本進(jìn)行驗證。如無法轉(zhuǎn)移，建議建立參考區(qū)間。

4、不同方法學(xué)產(chǎn)品的舉例說明

4.1采用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的檢測試劑

(1)確定臨界值中的n數(shù)值以及陰性樣品A值的標(biāo)準(zhǔn)差（臨界值=陰性樣品平均A值+nx標(biāo)準(zhǔn)偏差）；

（2)使用臨床樣本驗證臨界值，包括陰性樣本和陽性樣本。推薦采用ROC曲線法,納入一定數(shù)量的弱陽性樣本進(jìn)行驗證。

4.2基于實時熒光PCR等方法的沙眼衣原體和/或淋病奈瑟菌核酸檢測試劑

對于熒光實時PCR方法即為用于結(jié)果判讀的Ct值的確定，包括確定基線閾值（threshold)和閾值循環(huán)數(shù)（Ct)的研究等。樣本來源于各種可能接受沙眼衣原體和/或淋病奈瑟菌感染檢查的人群，包括尿道拭子、宮頸拭子或陰道拭子、尿液或其他泌尿生殖道樣本。建議樣本總數(shù)不少于100例，注意納入一定數(shù)量的弱陽性樣本進(jìn)行研究。如采用稀釋方式獲得低濃度樣本,應(yīng)同時考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，建議采用臨床陰性樣本作為稀釋基質(zhì)。另外，建議充分考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標(biāo)人群的代表性有限（如不能充分覆蓋泌尿生殖道樣本中的干擾物質(zhì)），進(jìn)一步通過臨床評價驗證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

4.3基于免疫化學(xué)發(fā)光等方法的人細(xì)小病毒B19IgM/IgG抗體檢測試劑

申請人應(yīng)考慮不同地理區(qū)域流行病學(xué)背景以及免疫缺陷人群、免疫抑制人群與正常人群之間的差異，選擇具有代表性的樣本建立陽性判斷值。試驗所用樣本來源還應(yīng)考慮到年齡（成人或兒童）、不同的感染階段和晚期）的影響。建議樣本總數(shù)不少于l〇()例，注意納入一定數(shù)量的弱陽性樣本進(jìn)行研究。另外，建議充分考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標(biāo)人群的代表性有限（如不能充分覆蓋血液中的干擾物質(zhì)），進(jìn)一步通過臨床評價驗證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

4.4基于熒光原位雜交法的HER2基因擴增檢測試劑

可參考最新版臨床指南性文件建立陽性判斷值，并采用具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的樣本對判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)。應(yīng)包含HER2擴增、HKR2無擴增以及一定數(shù)量陽性判斷值附近的組織樣本，包括HER2/CEP17熒光信號總數(shù)比值在2附近（1.8?2.2),或者每個細(xì)胞的平均HER2拷貝數(shù)在4?6附近的樣本。首先設(shè)定檢測結(jié)果重復(fù)性較好的目標(biāo)，即HER2平均拷貝數(shù)或者HER2平均拷貝數(shù)/CEP17平均拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差/變異系數(shù)范圍驗收標(biāo)準(zhǔn)，確定初始統(tǒng)計細(xì)胞區(qū)域和數(shù)量，并在結(jié)果不確定時納入更多區(qū)域或數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。然后建議參照組織病理學(xué)特征或者1HC結(jié)果確定可能存在擴增的浸潤性乳腺癌/胃癌區(qū)域，選擇細(xì)胞核大小一致、胞核邊界完整、DAP染色均一、細(xì)胞核無重疊、熒光信號清晰的細(xì)胞，隨機計數(shù)2個區(qū)域中的至少20個細(xì)胞，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

4.5基于免疫組織化學(xué)法的雌激素受體、孕激素受體抗體試劑

可參考最新的國際、國內(nèi)診療指南等相關(guān)文獻(xiàn)資料。并對產(chǎn)品的染色特點進(jìn)行研究，包括陽性樣本中不同類型細(xì)胞的著色顏色、染色部位及不同強度陽性組織的染色特點等。注意納入充分覆蓋不同染色強度、不同陽性細(xì)胞百分比及ER/PR陰性的乳腺癌樣本進(jìn)行包含染色位置，染色強度和陽性細(xì)胞百分比數(shù)的評價，并明確樣本的背景信息。

4.6基于高通量測序法的胎兒染色體非整倍體（121、1'18、113)檢測試劑

在大樣本量以及數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的情況下，可采用Z-值（Z-sc〇re)算法確定孕婦外周血血漿中胎兒游離t)NA的數(shù)量，其中Z-值反應(yīng)的是當(dāng)前數(shù)值距離平均數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)距離，Z-值的應(yīng)用條件為大樣本量以及數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。

4.7多個目標(biāo)基因聯(lián)合檢測試劑

例如包含多個目標(biāo)基因的腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測試劑，可分別確定不同單個目標(biāo)基因和內(nèi)參基因Ct值的差值或者拷貝數(shù)的比值，并對結(jié)果進(jìn)行陰陽性判定。在此基礎(chǔ)上，采用邏輯回歸方程算法以及R0C曲線法，對Ct值進(jìn)行回歸分析擬合分析,具體為賦予各個自變量不同的加權(quán)系數(shù)并計算總體分值。再根據(jù)擬合值繪制R0C曲線，選擇約登指數(shù)最大值點或者平衡臨床性能最優(yōu)的靈敏度和特異性界值，從而確定陽性判斷值。如產(chǎn)品的臨床適應(yīng)癥為肝癌，應(yīng)至少納入正常健康人、不同類型肝炎病毒感染引起的肝炎、肝纖維化、肝硬化、不同類型肝炎病毒感染引起的肝癌（包括不同分期）、其他類型原發(fā)性肝癌、轉(zhuǎn)移性肝癌、其他類型消化道癌癥（如胃癌、腸癌）、其他相關(guān)的良惡性疾病患者的樣本建立陽性判斷值。上述樣本應(yīng)分為訓(xùn)練集和驗證集，分別包含數(shù)百例樣本，以保證算法模型的可靠性。另外，建議進(jìn)一步通過臨床評價確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

針對產(chǎn)品設(shè)計開發(fā)過程中存在的科學(xué)合理性不足的問題,必要的解決手段之一是指導(dǎo)企業(yè)如何規(guī)范并高效的開展臨床前研究，從而提高臨床試驗成功的可能性。本文在對目前我國相關(guān)產(chǎn)品注冊申報中存在的問題以及審評工作中存在的難點進(jìn)行全面梳理的基礎(chǔ)上，對體外診斷試劑陽性判斷值或參考區(qū)間確定的要點進(jìn)行了初步探討。預(yù)計將幫助生產(chǎn)企業(yè)更加科學(xué)合理地建立申報產(chǎn)品的陽性判斷值或參考區(qū)間，相應(yīng)地大幅提高產(chǎn)品設(shè)計開發(fā)的效率以及臨床試驗成功的概率。期待與各方協(xié)作探索更加優(yōu)化的產(chǎn)品評價路徑和方法，共同努力提高相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)效率以及提升研究質(zhì)量。