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嘉峪檢測網(wǎng) 2022-05-20 05:50
摘要：以藥物的作用機制為基礎(chǔ)，采用細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建特定基因修飾細(xì)胞系并開發(fā)相應(yīng)的檢測方法，可用于相關(guān)產(chǎn)品的生物檢定。這種基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法在藥物的質(zhì)量控制領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本文探討了基因修飾細(xì)胞系的構(gòu)建策略及檢測方法的基本原理，并概述了基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法在重組蛋白類、疫苗類、基因治療類等不同產(chǎn)品質(zhì)量評價中的研究進(jìn)展及應(yīng)用情況。
關(guān)鍵詞：基因修飾細(xì)胞系；生物檢定法；細(xì)胞法；報告基因法；活性/效價測定
Abstract: Based on the mechanism of action of drugs, specific gene modified cell lines are constructed using cell and molecular biology technologies, and corresponding test methods are developed, which can be used for biological assays of related products. These genetically modified cell based bioassays have a wide application prospect in the field of pharmaceutical quality control. In this paper, the construction strategies of genetically modified cell lines and the basic principles of detection methods are discussed, and the research progress and application of genetically modified cellbased bioassays in the quality evaluation of recombinant proteins, vaccines, and gene therapy products are summarized.
Key words: genetically modified cells; bioassays; cellbased bioassays; reporter gene assays；bioactivity/potency determination
生物檢定法是利用生物體包括整體動物、離體組織、器官、細(xì)胞和微生物等評估藥物生物活性的一種方法?！吨腥A人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020年版三部通則中共收錄36個品種的39種生物活性/效價測定法，其中動物法15種，基于原代血液細(xì)胞/血清的方法9種，基于細(xì)胞系的方法13種(其中兩種為報告基因細(xì)胞系)，生化試驗2種[1]。目前動物法主要用于疫苗類制品的效價測定，重組蛋白質(zhì)/多肽類藥物多采用細(xì)胞法。
依賴于實驗動物的方法操作繁瑣，變異度大，且目前國際上推行實驗動物“3R”原則[減少(reduction)、替代(replacement)和優(yōu)化(refinement)]，《中國藥典》2020年版三部凡例二十五項也提出“應(yīng)盡量采用準(zhǔn)確的理化分析方法或體外生物學(xué)方法取代動物試驗進(jìn)行生物制品質(zhì)量檢定，以減少動物的使用。”因此，各國監(jiān)管部門和藥品生產(chǎn)企業(yè)都在積極嘗試減少動物實驗，在放行檢驗中采用基于細(xì)胞系的檢測方法(cellbased bioassay)。隨著基于細(xì)胞系的生物檢定法的應(yīng)用日益廣泛，早期的動物試驗逐漸被細(xì)胞試驗所替代。細(xì)胞法一般通過檢測細(xì)胞表型變化，如增殖、凋亡等來測定生物活性，但是表型變化一般需要2～7 d，或者變化不明顯，加上藥物受體分布的組織器官特異性，通常難以獲得合適的活性測定用細(xì)胞。因此，目前某些生物檢定仍需依賴于動物實驗，或現(xiàn)有的細(xì)胞法存在缺陷，尤其是很多創(chuàng)新生物技術(shù)藥，如endostatin等，目前仍未解決活性測定難題。
采用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)對初始細(xì)胞進(jìn)行有目的的基因修飾，建立藥物反應(yīng)性的細(xì)胞模型，并開發(fā)相應(yīng)的活性檢測方法，可用于生物學(xué)活性測定等生物檢定。報告基因法是目前最常用的方法，報告基因是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，如綠色熒光蛋白、熒光素酶等，將藥物特異的DNA反應(yīng)元件與報告基因結(jié)合后導(dǎo)入初始細(xì)胞，檢測藥物作用后報告基因表達(dá)的變化來測定活性，這種方法快速簡便，一般數(shù)小時內(nèi)即可完成檢測。《中國藥典》2015年版收錄了干擾素報告基因法，這也是國際上首例藥典收錄的基于基因修飾細(xì)胞的活性測定方法，《中國藥典》2020年版又收錄了康柏西普的報告基因測活方法[1]。目前這種基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法應(yīng)用日益廣泛，不僅涉及細(xì)胞因子類、激素類、單克隆抗體類、疫苗類、基因治療類等多種產(chǎn)品的活性/效價測定，還擴展到某些活性雜質(zhì)的檢測(表1)。為了規(guī)范和指導(dǎo)基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法的開發(fā)和應(yīng)用，在國家藥典委的資助下，由中國食品檢定研究院牽頭組織相關(guān)領(lǐng)域的專家起草了“基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法”通則，目前處于公示階段。本文通過概述基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用情況，對通則內(nèi)容進(jìn)行深入解讀。
1 細(xì)胞法基本原理
細(xì)胞法是基于待測物的主要作用機制，包括作用位點、胞內(nèi)信號通路及效應(yīng)分子，結(jié)合臨床相關(guān)性，選擇響應(yīng)值高、易檢測的信號分子或效應(yīng)分子作為檢測指示物。作用位點是指待測物結(jié)合并發(fā)揮作用的蛋白或其他分子，如受體或配體；胞內(nèi)信號通路涉及受體的活化、級聯(lián)反應(yīng)的酶類、信號分子等，例如環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)、Ca2＋、轉(zhuǎn)錄因子等；效應(yīng)分子一般包括各類效應(yīng)蛋白，例如酶類、細(xì)胞因子等；臨床相關(guān)性即某個信號通路與待測物發(fā)揮臨床效能的相關(guān)性，通常胞內(nèi)信號通路都不是單一的，每條信號通路產(chǎn)生的效應(yīng)可能并不相同，可能跟細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞遷移相關(guān)，因此要考慮其臨床相關(guān)性；檢測指示物即實施終點檢測的目標(biāo)分子，其含量與待測物的活性呈相關(guān)性，可能是正相關(guān)也可能是負(fù)相關(guān)，通常會選擇酶類進(jìn)行檢測，因為酶促反應(yīng)具有放大性，可以產(chǎn)生更高的響應(yīng)值，例如常規(guī)的細(xì)胞增殖和凋亡試驗采用氧化磷酸化相關(guān)的酶作為檢測指示物，加入顯色染料(MTT、MTS等)后采集光信號值。
2 基因修飾細(xì)胞系
敏感性細(xì)胞系是生物檢定法的前提，當(dāng)無法獲得滿足檢測需求的細(xì)胞時，例如待測物作用位點表達(dá)量低或無適宜檢測指示物時，可以通過基因修飾的方式構(gòu)建檢測用細(xì)胞。
2.1 構(gòu)建策略
根據(jù)待測物的作用特性和初始細(xì)胞的不同，可以采用不同的構(gòu)建策略，最終的目的都是優(yōu)化方法的靈敏度和信噪比，從而達(dá)到提高檢測準(zhǔn)確度和重復(fù)性的效果。通?？紤]增強細(xì)胞的靈敏度和信號強度，前者可以通過增加待測物作用位點表達(dá)量的方式，后者可以通過導(dǎo)入新的檢測指示物(如報告基因)或改造胞內(nèi)信號通路的方式。下面對常用的構(gòu)建策略進(jìn)行分類梳理。
2.1.1 增強細(xì)胞反應(yīng)性 當(dāng)初始細(xì)胞存在適宜的檢測指示物，但細(xì)胞對待測物反應(yīng)不敏感(作用位點缺失或表達(dá)不足)，可通過直接導(dǎo)入作用位點等方式增強其反應(yīng)性，如，腦利鈉肽受體為鳥苷酸環(huán)化酶，與腦利鈉肽結(jié)合后，可激活胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶活性催化GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，cGMP生成量與腦利鈉肽活性呈正比。HEK293細(xì)胞本身不表達(dá)腦利鈉肽受體，將腦利鈉肽受體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，通過ELISA檢測cGMP的含量，可用于測定腦利鈉肽生物學(xué)活性[2]。除了直接導(dǎo)入作用位點，也可以通過其他方式增強細(xì)胞反應(yīng)性，例如增加信號通路中某個效應(yīng)分子的表達(dá)，也可上調(diào)細(xì)胞的反應(yīng)性。
2.1.2 導(dǎo)入檢測指示物 當(dāng)初始細(xì)胞缺少適宜的檢測指示物，可根據(jù)待測物作用特點及胞內(nèi)信號通路，向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入易于檢測的指示物，常用的策略是報告基因法：當(dāng)待測物作用位點表達(dá)適量并存在特異性激活的轉(zhuǎn)錄因子時，可將相應(yīng)的DNA反應(yīng)元件與報告基因序列結(jié)合并導(dǎo)入初始細(xì)胞，建立反應(yīng)性報告基因細(xì)胞系。例如，將干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)熒光素酶報告基因?qū)際EK293細(xì)胞，通過檢測熒光素酶表達(dá)量，測定Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性[3]。也可通過改造胞內(nèi)信號通路的方式導(dǎo)入檢測指示物，以VEGFtrap為例，將 VEGFR1的胞外區(qū)分別與 IL18受體α(IL18Rα)和IL18 受體β(IL18β)的胞內(nèi)區(qū)融合而成嵌合受體，并與NFκB 熒光素酶報告基因共同導(dǎo)入HEK293細(xì)胞，VEGFR1 與VEGF 結(jié)合后發(fā)生二聚化，使得 IL18Rα 和 IL18β胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，并傳遞信號，激活 NFκB 驅(qū)動的熒光素酶報告基因表達(dá)，而VEGFtrap可以劑量依賴性抑制VEGF誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)[4]。
2.1.3 增強細(xì)胞反應(yīng)性同時導(dǎo)入檢測指示物 當(dāng)初始細(xì)胞缺少適宜的檢測指示物，且對待測物反應(yīng)不敏感，可在增強細(xì)胞反應(yīng)性的同時導(dǎo)入檢測指示物。當(dāng)存在特異性激活的轉(zhuǎn)錄因子時，可同時將待測物作用位點和相應(yīng)的DNA反應(yīng)元件報告基因?qū)氤跏技?xì)胞，建立反應(yīng)性報告基因細(xì)胞系。例如，將胰高血糖素樣肽1(GLP1)受體和cAMP反應(yīng)元件(CRE)熒光素酶報告基因同時導(dǎo)入CHOK1細(xì)胞，通過檢測熒光素酶表達(dá)量來測定GLP1及其類似物的生物學(xué)活性[5]。
2.1.4 其他策略 除了增加細(xì)胞的反應(yīng)性，還可以改造細(xì)胞特性使細(xì)胞更加穩(wěn)定，例如通過導(dǎo)入SV40大T抗原構(gòu)建永生化細(xì)胞來解決原代細(xì)胞培養(yǎng)不穩(wěn)定的缺陷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，雙報告基因、生物傳感器、互補熒光素酶、基因編輯等新技術(shù)新方法不斷的應(yīng)用到生物檢定方法的開發(fā)中，解決更多檢測難題。
雙報告基因，即在一個細(xì)胞同時導(dǎo)入兩個獨立測量的報告基因，其中一個報告基因的表達(dá)與待測物濃度相關(guān)，而另一個報告基因的組成型表達(dá)提供內(nèi)對照，可減少細(xì)胞活力、數(shù)量及裂解效率等內(nèi)在因素造成的變異，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確[6]。
生物傳感器，將螢光素酶基因進(jìn)行改造，加入胞內(nèi)第二信使cAMP或cGMP的結(jié)合位點，與cAMP或cGMP結(jié)合后可發(fā)生構(gòu)象改變而激活，催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，可用于G蛋白偶聯(lián)受體類藥物的活性檢測[7]。
互補熒光素酶，把熒光素酶分成兩部分NLuc和CLuc，然后將胞內(nèi)信號通路中發(fā)生相互作用的蛋白A和B分別與NLuc和CLuc構(gòu)成融合蛋白AnLuc和BcLuc，藥物激活胞內(nèi)信號通路后，A和B發(fā)生相互作用使NLuc和CLuc靠近形成完整的熒光素酶，通過檢測熒光素酶活性反映藥物活性[8]。
基因編輯，當(dāng)藥物的特異性受體和作用機制不明時，可采用基因編輯技術(shù)，對細(xì)胞進(jìn)行隨機改造，通過藥物篩選，獲得敏感性細(xì)胞，例如CRISPER/Cas9技術(shù)構(gòu)建EGF依賴的檢測用細(xì)胞[9]。
2.2 穩(wěn)定性評價
為保證生物檢定法的穩(wěn)定性，基因修飾細(xì)胞系應(yīng)建庫管理，細(xì)胞庫的建立、管理和質(zhì)量控制可參照《中國藥典》2020年版相關(guān)要求。如必要，在生長培養(yǎng)基中加入維持劑量的篩選試劑以防止外源基因丟失，保證基因修飾細(xì)胞的穩(wěn)定性?；蛐揎椉?xì)胞的穩(wěn)定性評價一般包括遺傳水平和功能水平，前者可采用PCR的方法檢測外源基因的拷貝數(shù)[10]，采用免疫印跡、流式免疫熒光等方法檢測目的蛋白的表達(dá)情況等進(jìn)行評價[2]，后者可通過細(xì)胞對待測物的檢測靈敏度、信噪比等進(jìn)行評價[11]。
3 基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法
基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法主要用于生物學(xué)活性、效價測定，也可用于某些雜質(zhì)的含量測定，其方法建立和驗證過程與傳統(tǒng)細(xì)胞法類似。根據(jù)待測物的作用機制，選擇特異性好、易檢測的指示物及相應(yīng)的檢測方法。根據(jù)檢測目的進(jìn)行合理的實驗設(shè)計，一般試驗過程包括：細(xì)胞制備、樣品溶液的制備、加樣并孵育、目標(biāo)指示物的檢測。除少部分可直接檢測的目標(biāo)指示物(如熒光蛋白)外，間接檢測的目標(biāo)指示物，通常需加入特定的染料或底物，再進(jìn)行信號采集，如光密度(OD)、化學(xué)發(fā)光或熒光信號。某些情況下，還需要采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、PCR等更加復(fù)雜的方式檢測目標(biāo)指示物。通過合理的試驗設(shè)計來確定細(xì)胞數(shù)量、待測物的作用濃度和范圍、作用時間等關(guān)鍵試驗參數(shù)，并參考《中國藥典》2015年版通則9401“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導(dǎo)原則”的相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)驗證[1]。
根據(jù)檢測方法，可分為直接法和競爭抑制法。以最常用的報告基因法為例，直接法是待測物直接作用細(xì)胞后，經(jīng)過一系列信號傳導(dǎo)和級聯(lián)反應(yīng)，激活DNA反應(yīng)元件，啟動報告基因表達(dá)，通過檢測報告基因表達(dá)量的變化來測定供試品的生物學(xué)活性，多用于細(xì)胞因子類藥物，如干擾素報告基因法[3]；競爭抑制法是采用特定誘導(dǎo)物刺激細(xì)胞，激活報告基因表達(dá)，再加入待測物競爭性抑制報告基因的表達(dá)，多用于單抗類藥物，例如IL6靶點抗體類藥物的報告基因法[12]。
根據(jù)檢測體系，可分為單細(xì)胞系統(tǒng)和多細(xì)胞系統(tǒng)。對于細(xì)胞因子類，通常采用單個細(xì)胞即可滿足檢測需求，而某些單抗產(chǎn)品需要采用雙細(xì)胞報告基因系統(tǒng)。目前雙細(xì)胞報告基因系統(tǒng)主要分為兩類：1)基因修飾的效應(yīng)細(xì)胞，以單抗的ADCC活性為例，F(xiàn)cγRIIIa/FcεRIγ融合受體與NFAT報告基因共同導(dǎo)入Jurkat細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，單抗藥物與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合后可激活效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)報告基因的表達(dá)[13]；2)基因修飾的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，以PD1/PDL1靶點單抗為例，PDL1和antiCD3 scFv共同導(dǎo)入CHO細(xì)胞作為靶細(xì)胞，PD1和NFAT報告基因共同導(dǎo)入Jurkat細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，PD1與PDL1結(jié)合后抑制效應(yīng)細(xì)胞激活引起的報告基因表達(dá)，而PD1/PDL1靶點藥物可以劑量依賴性逆轉(zhuǎn)這種抑制作用[14]。
4 應(yīng)用舉例
基因修飾細(xì)胞在藥物研發(fā)和生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛，從早期的藥物篩選到后期的質(zhì)量控制，都發(fā)揮著重要的作用。在生物檢定領(lǐng)域，涉及品種包括細(xì)胞因子、激素、單克隆抗體、融合蛋白、基因治療產(chǎn)品等多種藥物，涉及項目除了生物學(xué)活性/效價、滴度測定，還擴展到某些活性雜質(zhì)的檢測(表1)[15]。
4.1 重組蛋白類產(chǎn)品的生物學(xué)活性測定
基因修飾細(xì)胞法最早應(yīng)用于細(xì)胞因子類產(chǎn)品的生物學(xué)活性測定，后來逐漸應(yīng)用到激素、單抗、融合蛋白等多種重組蛋白類產(chǎn)品的活性測定。目前已有多個研究建立了基于報告基因的替代或補充方法，用于替代早期的動物試驗或提高原有細(xì)胞法的靈敏度和穩(wěn)定性。例如目前藥典收錄的生長激素生物測定法為去垂體大鼠體重法和去垂體大鼠脛骨法，需要去垂體大鼠模型，已有研究建立基于報告基因的方法，將生長激素受體和特定的DNA反應(yīng)元件報告基因同時導(dǎo)入HEK293細(xì)胞，建立的報告基因細(xì)胞系對生長激素類產(chǎn)品具有良好的劑量依賴效應(yīng)[11]。由于單抗的作用特性，目前大部分單抗產(chǎn)品都采用了基于報告基因的競爭抑制法測定其活性，例如VEGF/VEGFR、IL6/IL6R、EGF/EGFR、PD1/PDL1等靶點的單抗制品，以及ADCC、ADCP活性[1214，21，22，30，31]。
4.2 疫苗類產(chǎn)品效價測定
中和抗體是評價疫苗免疫保護(hù)效果的一項重要指標(biāo)，基本原理是將待測疫苗免疫敏感動物后，測定血清中特異性中和抗體的含量來反映疫苗效價。通常采用基于細(xì)胞的方法，觀察待測血清能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)或病毒空斑形成等，為了減少生物安全風(fēng)險，目前多采用假病毒進(jìn)行測試[32]。由于某些病毒的培養(yǎng)特性，需要通過基因修飾的方式構(gòu)建敏感細(xì)胞，例如，構(gòu)建血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)過表達(dá)的293T細(xì)胞用于檢測新型冠狀病毒(SARSCoV2)的中和抗體效價[23]；構(gòu)建登革熱病毒衣殼蛋白穩(wěn)定表達(dá)的蚊子細(xì)胞結(jié)合改構(gòu)的登革熱報告基因病毒，用于檢測登革熱病毒中和抗體[24]；構(gòu)建多受體共表達(dá)的TZMbl(CXCR4＋CD4＋CCR5＋)報告基因細(xì)胞系檢測HIV中和抗體[25]。
表1 基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法應(yīng)用舉例
Tab.1 Examples of genetically modified cellbased bioassays
4.3 基因治療產(chǎn)品的感染滴度及效價測定
目前很多基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量評價都要用到基因修飾細(xì)胞系，以重組腺相關(guān)病毒(rAAV)為例，滴度檢測方法為TCID50法，由于rAAV缺少復(fù)制必需的Rep、Cap基因，將Rep、Cap基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，當(dāng)rAAV與輔助病毒共感染該細(xì)胞時，rAAV基因組就會進(jìn)行復(fù)制，再通過QPCR檢測基因組滴度，從而測定病毒感染滴度[26，27]?；蛑委煯a(chǎn)品的效價指標(biāo)包括所攜帶目的基因的表達(dá)量和表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。靶向神經(jīng)系統(tǒng)的rAAV產(chǎn)品一般會采用神經(jīng)特異性的啟動子，而很多神經(jīng)特異性的啟動子只有在Cre表達(dá)陽性的神經(jīng)細(xì)胞才能被激活，常規(guī)用于評價的細(xì)胞系如HEK293并不適宜評價此類產(chǎn)品，已有研究構(gòu)建了Cre重組酶穩(wěn)定表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SHSY5Y，用來評價靶向神經(jīng)系統(tǒng)的rAAV產(chǎn)品的效價[28]。目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性可參考蛋白類產(chǎn)品活性測定方法，某些產(chǎn)品可能需要采用目標(biāo)基因缺失的細(xì)胞模型來評價，可以通過患者供體細(xì)胞分離培養(yǎng)獲得，也可通過基因敲除構(gòu)建所需細(xì)胞模型。
4.4 其他應(yīng)用
除了針對藥效成分，基因修飾細(xì)胞系還可用于活性雜質(zhì)的檢測。已有研究者開發(fā)了基于報告基因的熱原檢測方法，NFκB是熱原誘導(dǎo)的促炎作用的關(guān)鍵信號分子，將NFκB反應(yīng)元件報告基因?qū)隦AW264.7細(xì)胞建立報告基因細(xì)胞系，對不同來源的熱原均有良好的量效反應(yīng)，可用于包括疫苗、單抗在內(nèi)的不同類型產(chǎn)品中的熱原檢測[24]。
5 總結(jié)
基于基因修飾細(xì)胞系的生物檢定法可以解決多種檢測難題，隨著藥靶作用機制的深入研究以及細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，可以根據(jù)藥物作用機制及其臨床相關(guān)性，更加自如的構(gòu)建出滿足檢測需求的基因修飾細(xì)胞，并開發(fā)出靈敏、穩(wěn)定的檢測方法應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制，以促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高，保障臨床用產(chǎn)品的安全、有效和質(zhì)量可控。
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《中國藥品標(biāo)準(zhǔn)》雜志 2022年第23卷第2期：于雷， 周勇， 王軍志；(中國食品藥品檢定研究院， 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室， 北京 100050)
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