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近年來，隨著分子診斷技術(shù)的升級迭代，分子診斷的臨床應(yīng)用也越來越廣泛，分子診斷市場進(jìn)入了快速發(fā)展期。PCR是使用最為廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)，以其靈敏性、特異性而被廣泛應(yīng)用，然而PCR需要反復(fù)的熱變性，無法擺脫依賴儀器設(shè)備的局限，從而限制了其在臨床現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。自20世紀(jì)90年代以來，很多實(shí)驗(yàn)室開始發(fā)展無需熱變性的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)?，F(xiàn)已開發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等技術(shù)。本文將帶讀者共同揭開等溫?cái)U(kuò)增應(yīng)用最廣泛的技術(shù)——LAMP的“神秘面紗”。

 

- 01 -LAMP基本介紹

 

2000年日本學(xué)者Notomi博士在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。LAMP技術(shù)的橫空出世，受到了來自世衛(wèi)組織WHO、各國學(xué)者和相關(guān)政府部門的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中，在2009年甲型H1N1流感事件中，日本榮研化學(xué)株式會社（以下簡稱“榮研公司”）接受WHO的邀請完成了H1N1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒的研制，通過早期快速診斷對防止該病癥的快速蔓延起到積極作用。

 

LAMP針對6個位點(diǎn)使用4-6條引物（普通PCR使用2條引物），因此基因組序列上的多個區(qū)域可作為特異性的靶標(biāo)。相比大多數(shù)基于普通PCR的檢測方法，這種DNA合成起始點(diǎn)的增加使得檢測特異性和靈敏度得到增強(qiáng)。當(dāng)合成開始后，引物對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，加速后續(xù)的擴(kuò)增。

 

LAMP中常使用的酶是Bsm DNA polymerase，其來源于Bacillus smithii聚合酶的一部分，等同于Bst DNA polymerase大片段。Bsm具有強(qiáng)鏈置換活性，最佳反應(yīng)溫度為60°C。這種酶的擴(kuò)增效率非常高，在15分鐘內(nèi)即可進(jìn)行十億倍的擴(kuò)增。同時(shí)其高度耐受復(fù)雜樣本中的抑制劑，所以可對植物組織、血液、尿液和口腔拭子等樣本進(jìn)行檢測。

 

LAMP反應(yīng)會產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，其從溶液中沉淀出來，使溶液變得渾濁。可以通過濁度分析或染料來監(jiān)測反應(yīng)。羥基萘酚藍(lán)（HNB）會由紫色變?yōu)樗{(lán)色。鈣黃綠素，當(dāng)鎂離子存在時(shí)，經(jīng)錳淬火，由橙色變?yōu)辄S綠色。SYBR Green、EvaGreen® (Biotium)和berberine為核酸特異性染料，在紫外光下可發(fā)射熒光信號。通過比色檢測簡單快速，但不能提供準(zhǔn)確定量。可根據(jù)檢測需求，選用最佳的檢測方法[1]。

 

表1. LAMP和PCR技術(shù)的比較

 

- 02 -LAMP等溫?cái)U(kuò)增原理

 

最初LAMP反應(yīng)是針對靶標(biāo)的六個區(qū)域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）設(shè)計(jì)四條引物，包括一對外引物（F3&B3）和一對內(nèi)引物（FIP&BIP）。其擴(kuò)增原理是基于DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時(shí)，另一條鏈就會解離，變成單鏈。DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。先確定目標(biāo)基因上的6個特異性區(qū)域F3、F2、F1、B1、B2、B3，然后依據(jù)這6 個特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物：

 

?正向內(nèi)引物(forwardinner primer，F(xiàn)IP)，由F1c 和F2 組成。

 

?反向內(nèi)引物(backwardinner primer，BIP)，由B1c 和B2 組成，中間均以TTTT作為間隔。

 

?外引物F3、B3 分別由目的基因上的F3、B3 區(qū)域組成。

 

在LAMP 反應(yīng)體系中，內(nèi)引物的濃度是外引物濃度的幾倍。內(nèi)引物先與模板鏈結(jié)合合成互補(bǔ)鏈，形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結(jié)合，形成DNA雙鏈，在Bst DNA 聚合酶的作用下，釋放出由內(nèi)引物合成的互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈經(jīng)過一系列反應(yīng)最終形成具有啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA單鏈。以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，由內(nèi)外引物引導(dǎo)過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng)，最后形成具有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度不一的DNA混合物。

 

圖1.  LAMP擴(kuò)增原理

 

- 03 -LAMP引物設(shè)計(jì)原則

 

根據(jù)前文提及，LAMP引物一般有4-6條（包含環(huán)引物的存在）。引物設(shè)計(jì)時(shí)主要需要考慮三個因素：長度，Tm值，間距。一般采用Bst酶的LAMP默認(rèn)引物參數(shù)如下表格：

 

表2. LAMP引物設(shè)計(jì)參數(shù)

 

需要注意的是當(dāng)采用LavaLAMPTM體系時(shí)，默認(rèn)Tm值需要提高6℃。

 

除此之外，LAMP引物設(shè)計(jì)還需遵從以下原則：

 

① 一般GC含量為40-60%；

 

② 靶標(biāo)序列長度≤280bp；

 

③ 避免引物中單堿基或雙堿基重復(fù)3次以上（如ACCC，ATATAT），減少引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增；

 

④ 引物對應(yīng)具有相似的Tm值，最大相差不超過5 ℃；

 

⑤ 避免引物形成二級結(jié)構(gòu)（引物內(nèi)超過3個堿基互補(bǔ)或引物間具有互補(bǔ)序列）；

 

⑥ 在進(jìn)行引物篩選時(shí)，引物二聚體ΔG≥-3.5，引物末端ΔG≤-4。

 

- 04 -LAMP的優(yōu)勢與不足

 

? LAMP 的優(yōu)勢：

 

（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10個拷貝的目的基因，擴(kuò)增效率為普通PCR的10 倍-100 倍。

 

（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。

 

? LAMP 的不足：

 

（1）對引物的要求特別高。

 

（2）擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆測序，只能用于判斷。

 

（3）由于其敏感性強(qiáng)，容易形成氣溶膠，造成假陽性，影響檢測結(jié)果。

 

- 05 -等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)匯總

 

常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)除了LAMP還有RCA、NASBA等：

 

表3. 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)匯總

 

- 06 -諾唯贊解決方案

 

為了滿足廣大客戶開發(fā)更多POCT產(chǎn)品的需求，諾唯贊推出了適用于LAMP等溫?cái)U(kuò)增的系列產(chǎn)品?？焖倬酆系耐瑫r(shí)（最快可在30min以內(nèi)），在擴(kuò)增靈敏度和擴(kuò)增效率等方面均具有明顯提升，同時(shí)，Bst II Pro DNA Polymerase Large Fragment（Vazyme#P703）具有更強(qiáng)的特異性，解決了LAMP中常見的NTC起峰問題。

 

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1]Fischbach J et al. (2018) Shining a light on LAMP assays' A comparison of LAMP visualization methods including the novel use of berberine. BioTechniques 58(4):189-94.