中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

摘要：《中國(guó)藥典》2020年版新增通則<3429>免疫化學(xué)法。為更好地理解通則，本文從通則的新增背景、起草過(guò)程、國(guó)內(nèi)外藥典比較、通則內(nèi)容解讀以及本法在生物制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用幾個(gè)方面進(jìn)行簡(jiǎn)述，旨在為本通則的順利實(shí)施提供應(yīng)用指南。

 

關(guān)鍵詞：《中國(guó)藥典》2020年版；免疫化學(xué)法；生物制品；質(zhì)量控制；應(yīng)用

 

Abstract: <3429 >The section Immunochemical Methods has been adopted as a new general chapter in the Chinese Pharmacopoeia 2020.To better understand this general chapter, this paper briefly describes the background, drafting process, comparison of domestic and foreign pharmacopoeias, interpretation of the general chapter and application of the methods in the quality control of biological products. That aims to provide an application guide for the successful implementation of the general chapter.

 

Key words: Chinese Pharmacopoeia 2020; immunochemical methods; biological products; quality control; application

 

免疫化學(xué)法是基于抗原抗體的特異性、可逆性、非共價(jià)結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種分析方法，已廣泛應(yīng)用于生物制品的鑒別、純度/雜質(zhì)分析、效價(jià)測(cè)定、穩(wěn)定性及其他質(zhì)量屬性的考察[1]。除JP外[2]，BP自1993版、EP自第3版和USP自36版均已收載了免疫化學(xué)方法的通用技術(shù)要求，其定義基本一致，且均收載了多種傳統(tǒng)經(jīng)典/前沿的檢測(cè)方法，此外USP對(duì)免疫學(xué)檢測(cè)方法的選擇、方法建立時(shí)需考慮的關(guān)鍵因素、方法驗(yàn)證的要求以及數(shù)據(jù)報(bào)告要求的介紹更為全面系統(tǒng)[3-­8]。《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)2015年版收載了免疫印跡法、免疫斑點(diǎn)法、免疫雙擴(kuò)散法、免疫電泳法、酶免疫分析法、血凝法、單向免疫擴(kuò)散法和放射免疫法等免疫化學(xué)法，常應(yīng)用于疫苗類(lèi)制品、抗毒素、抗血清類(lèi)制品、血液制品和基因工程藥的定性和定量檢測(cè)[9]，但收載的各具體方法較為零散，缺少系統(tǒng)化規(guī)范化。為指導(dǎo)并規(guī)范生物制品相關(guān)免疫化學(xué)方法的建立和應(yīng)用，《中國(guó)藥典》2020年版新增了通則<3429>免疫化學(xué)法，本通則由上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院牽頭，聯(lián)合中國(guó)食品藥品檢定研究院、廣東省食品藥品檢驗(yàn)研究院和江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院共同起草完成。為更好地理解本通則，并推進(jìn)本通則的順利實(shí)施，本文著重對(duì)免疫化學(xué)法通則的增訂情況和在生物制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用進(jìn)行了介紹。

 

1  現(xiàn)行版國(guó)內(nèi)外藥典比較

 

從總體框架來(lái)看，EP10.0/BP2022和USP的免疫化學(xué)法總則及其相關(guān)通則和應(yīng)用均分為三個(gè)層級(jí)結(jié)構(gòu)：EP10.0/BP2022分為免疫化學(xué)方法通則、應(yīng)用于某個(gè)品種某個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的具體方法通則和各論項(xiàng)3個(gè)層級(jí)；而USP中分為免疫化學(xué)方法總則、某一大類(lèi)檢測(cè)方法通則和各論項(xiàng)3個(gè)層級(jí)。《中國(guó)藥典》2020年版的免疫化學(xué)法通則及相關(guān)通則和應(yīng)用的框架與EP10.0類(lèi)似，具體到免疫化學(xué)法通則，分為前言和檢測(cè)方法介紹兩大部分，其中前言部分包括了定義、應(yīng)用范圍、分類(lèi)、方法開(kāi)發(fā)、方法驗(yàn)證總的要求；檢測(cè)方法部分參考了EP10.0/BP2022，分為標(biāo)記免疫化學(xué)法和非標(biāo)記免疫化學(xué)法，收入的方法類(lèi)別較EP/BP更多，且方法闡述得更細(xì)；在附錄部分參考USP將各類(lèi)方法的優(yōu)缺點(diǎn)和典型用途匯總，以表格形式呈現(xiàn)。具體詳見(jiàn)表1[1，10-12]。

 

2  本通則主要內(nèi)容解讀與應(yīng)用

 

本通則具體可分為前言、標(biāo)記免疫化學(xué)法、非標(biāo)記免疫化學(xué)法和附錄四部分內(nèi)容，包括了10個(gè)具體方法，各方法對(duì)應(yīng)的在《中國(guó)藥典》2020年版應(yīng)用詳見(jiàn)表2。

 

2.1  前言

 

前言部分概述了免疫化學(xué)法的定義、應(yīng)用范圍及本通則相關(guān)要求的適用范圍，闡述了免疫化學(xué)法的分類(lèi)，并根據(jù)免疫化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)指出非標(biāo)記免疫化學(xué)法可通過(guò)采用標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)記免疫化學(xué)法。此外，值得注意的是，首次提出建立免疫化學(xué)法應(yīng)考慮采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)DOE和控制交叉反應(yīng)，在驗(yàn)證時(shí)應(yīng)符合的一般要求，并應(yīng)設(shè)置適宜的系統(tǒng)適用性要求，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

 

2.2  標(biāo)記免疫化學(xué)法

 

標(biāo)記免疫化學(xué)法共收錄了6個(gè)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法、放射免疫分析法3個(gè)常規(guī)方法和免疫熒光分析法、發(fā)光免疫化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)3個(gè)較為前沿的方法。每個(gè)方法均包含了定義、分類(lèi)及適用范圍、儀器的一般要求、對(duì)標(biāo)記物的一般要求和常用標(biāo)記方法和測(cè)定法四個(gè)部分。其中，標(biāo)記物與待標(biāo)記的抗原或抗體形成的結(jié)合物為每個(gè)標(biāo)記免疫化學(xué)法檢測(cè)的核心和基礎(chǔ)，因此該部分內(nèi)容針對(duì)每個(gè)特定的標(biāo)記免疫化學(xué)法而言也是特定的。

 

2.2.1  酶聯(lián)免疫吸附法  本法是《中國(guó)藥典》通則中收載最多的一類(lèi)檢測(cè)方法，使用的標(biāo)記技術(shù)主要為酶標(biāo)記技術(shù)，方法一般可分為直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法。值得關(guān)注的是，為保證我國(guó)藥典的與時(shí)俱進(jìn)，并與通則<1431>、通則<9401>等要求一致，在結(jié)果判定部分提出了臨界值的概念及其設(shè)定方法(定性分析)，必要時(shí)，應(yīng)報(bào)告測(cè)定結(jié)果的置信區(qū)間(用于生物制品效價(jià)測(cè)定變異度較大定量分析時(shí))?！吨袊?guó)藥典》2020年版在通則和各論中涉及到本法應(yīng)用均不少于10個(gè)，且以?shī)A心法為主，應(yīng)用于檢測(cè)疫苗中雜蛋白和抗生素殘留量居多，亦可用于體外效力、抗原含量和鑒別試驗(yàn)等。此外，隨著各類(lèi)抗體藥物的崛起，該法也常用于抗體類(lèi)藥物的鑒別試驗(yàn)、結(jié)合活性和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性的檢測(cè)。

 

2.2.2  免疫印跡法  本法主要分為電泳免疫印跡法和非電泳免疫印跡法，常用的標(biāo)記物有酶、熒光基團(tuán)或放射性核素?！吨袊?guó)藥典》2020年版收載的通則為<3401>免疫印跡法和<3402>免疫斑點(diǎn)法。免疫印跡法屬于電泳印跡法中的單向電泳印跡法，而免疫斑點(diǎn)法屬于非電泳印跡法。免疫印跡法可以用于生物技術(shù)藥物的定性和定量分析，例如各論注射用人白介素11就采用了免疫印跡法進(jìn)行菌種表達(dá)物體鑒定的檢查，而在重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)的原液中采用免疫印跡法進(jìn)行了純度的檢測(cè)；免疫斑點(diǎn)法則常用于基因工程藥的鑒別試驗(yàn)。

 

2.2.3  免疫熒光分析法  本法檢測(cè)基礎(chǔ)包括熒光抗體技術(shù)和熒光抗原技術(shù)，前者更常用。本法比較特殊的是，某些情況下并非采用熒光素標(biāo)記，也可利用某些酶的底物經(jīng)酶作用分解為具有強(qiáng)熒光的酶解產(chǎn)物的原理而采用酶標(biāo)記抗體。本法采用的技術(shù)較為前沿，《中國(guó)藥典》2020年版在通則項(xiàng)下收載本法2個(gè)，并在個(gè)別的疫苗各論項(xiàng)下有所提及，主要應(yīng)用于病毒滴定和鑒別、病毒滅活驗(yàn)證等。

 

2.2.4  發(fā)光免疫化學(xué)法  本法根據(jù)產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)的體系，可分為生物發(fā)光法和化學(xué)發(fā)光法。前者常用于生物學(xué)活性測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡等；后者常用在激素類(lèi)、腫瘤標(biāo)記物等臨床診斷領(lǐng)域。發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的抗原或抗體為本法檢測(cè)的基礎(chǔ)，目前常用的技術(shù)方法有基于熒光素酶與特定底物反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號(hào)值的熒光報(bào)告基因法、基于放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測(cè)的Alphascreen技術(shù)、基于酶解發(fā)光底物的化學(xué)發(fā)光酶促法、基于氧化還原的Almar Blue法等[13-­17]，常用于抗體類(lèi)藥物生物學(xué)活性的檢測(cè)?！吨袊?guó)藥典》2020年版收錄的通則<3535>康柏西普生物學(xué)活性測(cè)定法就屬于熒光報(bào)告基因法。

 

2.2.5  流式細(xì)胞術(shù)  本法是將細(xì)胞或病毒顆粒與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的一種方法，在本質(zhì)上屬于免疫熒光分析法，因此熒光素的選擇和標(biāo)記方法是本法的關(guān)鍵因素之一。其余注意事項(xiàng)包括細(xì)胞的選擇(應(yīng)為單細(xì)胞懸液)、設(shè)置陰性/陽(yáng)性對(duì)照、儀器補(bǔ)償設(shè)置、數(shù)據(jù)分析(設(shè)定噪音信號(hào)閾值和設(shè)門(mén))等。《中國(guó)藥典》2020年版收錄通則<3531>尼妥珠單抗相對(duì)結(jié)合活性測(cè)定法就采用了流式細(xì)胞術(shù)。此外，本法還常用于生物技術(shù)藥物的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等功能性檢測(cè)。

 

2.2.6  放射免疫分析法  本法檢測(cè)的基礎(chǔ)為放射性核素標(biāo)記的抗原或抗體，標(biāo)記抗原的放射免疫分析法(RIA)為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析，而標(biāo)記抗體的免疫放射分析法(RIMA)為非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析，其中RIA法應(yīng)用范圍更廣，可應(yīng)用于各類(lèi)激素、蛋白質(zhì)、抗原和小分子物質(zhì)的檢測(cè)。此外，本法通常使用市售的試劑盒，故應(yīng)注意符合試劑盒的系統(tǒng)適用性和質(zhì)量控制要求，并結(jié)合日常使用的分析試劑盒情況可根據(jù)具體檢測(cè)方法選用適宜的數(shù)學(xué)模型?！吨袊?guó)藥典》2020年版收錄的多個(gè)免疫球蛋白類(lèi)制品各論均采用放射免疫分析法測(cè)定抗HBs效價(jià)。

 

2.3  非標(biāo)記免疫化學(xué)法

 

標(biāo)記免疫化學(xué)法共收錄了4個(gè)方法，包括免疫沉淀法、免疫電泳法、凝集反應(yīng)3個(gè)常規(guī)方法和表面等離子共振法1個(gè)較前沿的方法。每個(gè)方法均包含了三個(gè)部分：定義、分類(lèi)及適用范圍、對(duì)儀器及試劑的一般要求和測(cè)定法。

 

2.3.1  免疫沉淀法  本法常用于定性分析，也可用于定量分析。主要分為液體內(nèi)沉淀反應(yīng)和凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)。《中國(guó)藥典》2020年版收錄通則5個(gè)和相關(guān)各論3個(gè)，其中最常用的為采用免疫雙擴(kuò)散法進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，此外可采用比濁法進(jìn)行IgG含量測(cè)定、IgA殘留量測(cè)定、人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性等實(shí)驗(yàn)，而單向免疫擴(kuò)散法最經(jīng)典的應(yīng)用是流感病毒裂解疫苗血凝素含量的測(cè)定。

 

2.3.2  免疫電泳法  《中國(guó)藥典》2020年版盡管收載了通則<3404>免疫電泳法，但實(shí)際對(duì)應(yīng)的為本法的經(jīng)典免疫電泳法，而火箭免疫電泳法、對(duì)流免疫電泳法和交叉免疫電泳法均由經(jīng)典免疫電泳法衍生而來(lái)?！吨袊?guó)藥典》2020年版收錄通則1個(gè)和相關(guān)各論2個(gè)，其中通則<3404>免疫電泳法的應(yīng)用最為廣泛，常用于生物制品的鑒別試驗(yàn)，而2個(gè)各論則是采用火箭免疫電泳法進(jìn)行多糖含量的檢測(cè)。藥典未收集對(duì)流免疫電泳法和交叉免疫電泳法的相關(guān)應(yīng)用，前者一般用于定性分析，后者可用于定性或定量分析。

 

2.3.3  凝集反應(yīng)  本法通常用于定性和半定量分析?！吨袊?guó)藥典》2020年版收錄了多個(gè)通則和相關(guān)各論，應(yīng)用范圍包括血清學(xué)特性/試驗(yàn)、抗原性試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、鑒別試驗(yàn)等。

 

2.3.4  表面等離子共振法  本法為較為前沿的免疫化學(xué)法，無(wú)需標(biāo)記，可實(shí)時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、核酸蛋白質(zhì)等生物分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，檢測(cè)靈敏度高，獲取結(jié)果快速簡(jiǎn)便，根據(jù)實(shí)時(shí)測(cè)定液固界面抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)偏振光折射的變化來(lái)檢測(cè)生物分子間相互作用的特異性和親和力大小及定量供試品中待測(cè)物的濃度。本法在方法開(kāi)發(fā)時(shí)的難點(diǎn)為選擇合適的抗體、芯片表面的固定和再生條件?！吨袊?guó)藥典》2020年版未收錄本法的相關(guān)應(yīng)用，但已有多個(gè)單抗品種的進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)收載了表面等離子共振技術(shù)作為結(jié)合活性的檢測(cè)方法[18]，另有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了本法在疫苗質(zhì)量分析中的應(yīng)用[19-21]。相較于傳統(tǒng)的ELISA法，表面等離子共振不需要制備標(biāo)記抗體，自動(dòng)化程度高，檢測(cè)時(shí)間短，可以實(shí)時(shí)反應(yīng)藥物和抗體的結(jié)合情況，避免獲得假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。相信表面等離子共振法作為前沿的技術(shù)，會(huì)有更廣泛的應(yīng)用，建立并收載為法定檢驗(yàn)方法。

 

2.4  附表

 

通則的附表里列出各類(lèi)免疫化學(xué)法的優(yōu)缺點(diǎn)及典型用途。以便于對(duì)免疫化學(xué)法的各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)、儀器設(shè)備需求可以有更直觀的了解，方便開(kāi)發(fā)方法或藥品檢定時(shí)，更快速方便的選取適合的方法。

 

3  結(jié)語(yǔ)與展望

 

近二十年，免疫化學(xué)法飛速發(fā)展，應(yīng)用領(lǐng)域逐漸廣泛，為與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌，《中國(guó)藥典》2020年版首次對(duì)各類(lèi)免疫化學(xué)法進(jìn)行了匯總并制定了相關(guān)通則。但是相較于USP和EP，我國(guó)藥典缺少酶聯(lián)免疫吸附法、表面等離子共振法等具體免疫化學(xué)法的通則，僅收載了具體品種應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法等某種具體的免疫化學(xué)法的通則，抑或在各論中提及具體的免疫化學(xué)法。在藥典未來(lái)的增修訂時(shí)，可以參考國(guó)外藥典，增訂酶聯(lián)免疫吸附法等免疫化學(xué)法的通則，使我國(guó)藥典的層級(jí)結(jié)構(gòu)更加完整。而隨著生物技術(shù)的發(fā)展，必定會(huì)涌現(xiàn)更多更新的免疫化學(xué)的方法、技術(shù)和應(yīng)用，免疫化學(xué)法通則將與時(shí)俱進(jìn)，逐漸完善。此外，隨著分析方法生命周期概念的出現(xiàn)，如何科學(xué)有效地進(jìn)行方法設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證、應(yīng)用以及上述過(guò)程中涉及的數(shù)據(jù)分析也是值得重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。例如：方法開(kāi)發(fā)選用酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)測(cè)定藥物結(jié)合活性時(shí)，對(duì)于數(shù)據(jù)的分析，通常選用四參數(shù)作為數(shù)據(jù)分析的理想模型，此時(shí)應(yīng)參見(jiàn)<1431>生物檢定統(tǒng)計(jì)法項(xiàng)下的四參數(shù)回歸計(jì)算法；對(duì)于方法的驗(yàn)證，考慮到結(jié)合活性測(cè)定方法為相對(duì)效價(jià)測(cè)定法，可依據(jù)通則<9401>生物制品活性/效價(jià)測(cè)定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則開(kāi)展相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證工作，因此，我們可結(jié)合本通則、<1431>生物檢定統(tǒng)計(jì)法項(xiàng)下的四參數(shù)回歸計(jì)算法和<9401>等多個(gè)通則技術(shù)要求，制定數(shù)據(jù)分析策略和方法驗(yàn)證策略。本通則作為免疫化學(xué)法總則，結(jié)合中國(guó)藥典收載的具體的方法通則和操作指南，可以在生物制品質(zhì)量控制中起到積極作用，為免疫化學(xué)方法的方法開(kāi)發(fā)、方法驗(yàn)證及完善方法學(xué)生命周期管理提供思路和技術(shù)指南。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1]  中華人民共和國(guó)藥典2020年版.三部[S]. 2020: 通則3429  ChP 2020. Vol Ⅲ [S]. 2020：General Chapters 3429

[2]  JP 19 [S]. 2021

[3]  BP 1993 [S]. 1993: 170

[4]  EP 3[S]. 1996：103

[5]  USP 36­NF31[S]. 2013：751

[6]  BP 2018 [S]. 2017：417

[7]  EP 9.0[S]. 2016：239

[8]  USP 40­NF35 [S]. 2016：1337

[9]  中華人民共和國(guó)藥典2015年版.三部[S]. 2015  ChP 2015. Vol Ⅲ [S]. 2015

[10]  BP 2022 [S]. 2021：451

[11]  EP 10.0[S]. 2019：261

[12]  USP General Chapter <1102>, Docld: 1_GUID­91053CC6­8F24­4B30­9CAE­361569837493_2_en­US

[13]  HAMIYET U. Luciferase reporter assay for unlocking ligand­mediated signaling of GPCRs [J]. Methods Cell Biol, 2019, 149：19

[14]  MUHAMMAD AA, MAYWAN H, ROHANA Y, et al. Development of a NS2B/NS3 protease inhibition assay using AlphaScreen® beads for screening of antidengue activites [J]. Heliyon, 2018, 4(12)：e01023

[15]  WEBER E, SCHORPP K, HADIAN K. Studying OTUD6BOTUB1 ProteinProtein Interaction by LowThroughput GFPTrap Assays and HighThroughput AlphaScreen Assays [J]. Mol Biol, 2021, 2261：381

[16]  ZHOU H, PAN S, TAN H, et al. A novel highsensitive indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on monoclonal antibody for tenuazonic acid (TeA) detection[J]. Eur Food Res Technol, 2022, 248(2)：577

[17]  SHARMA N, ARYA G, KUMARI RM, et al. Evaluation of anticancer activity of silver nanoparticles on the A549 human lung carcinoma cell lines through alamar blue assay [J]. Bio Protoc, 2019, 9(1)：e3131.

[18]  王鳴人，段徐華，邵泓，等. 表面等離子共振(SPR)技術(shù)在生物藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用前景[J].中國(guó)藥師， 2020，23(11)：2257

WANG MR, DUAN XH, SHAO H, et al. Application prospect of surface plasmon resonance technique in quality control of biopharmaceutical products [J]. China Pharm, 2020, 23(11)：2257

[19]  AZIZA PM, AMINE AK. Critical review of current and emerging quantification methods for the development of influenza vaccine candidates [J]. Vaccine, 2015, 33(44)：5913

[20]  RONALD D, GABRIEL O, KWINTEN S, et al. Comprehensive antigenic map of cleaved soluble HIV1 Envelope Trimer [J]. PloS PATHOG, 2015, 11(3)：e1004767

[21]  QUENTIN C, WALTHERE D, BRUCE L I, et al. Evaluation of potential immunogenicity differences betweenPandemrix™ and Arepanrix™[J]. Hum Vacc Immunother, 2016, 12(9)：2289