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摘要

作為藥物分析人員，在液相分析方法開(kāi)發(fā)階段可能遇到過(guò)這樣的化合物：化合物峰型展寬嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)譜峰裂分情況。使出洪荒之力，悻悻然發(fā)現(xiàn)，該異常現(xiàn)象非溶劑強(qiáng)度過(guò)高所致，非主成分基質(zhì)效應(yīng)所致，非流動(dòng)相pH不適所致，亦非高能σ鍵旋轉(zhuǎn)瞬時(shí)形成多重構(gòu)象所致。盯著化合物看半天，某個(gè)瞬間，目光中露出了然的神色，原來(lái)是這個(gè)家伙—酮式-烯醇互變化合物。

酮式-烯醇互變化合物一般存在如下結(jié)構(gòu)：羰基的鄰位碳上即α碳上連接著具有酸性的α-質(zhì)子?；プ儺悩?gòu)體是容易相互轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。   

酮式-烯醇互變化合物一般具有以下特性：

1）在酸性條件下，酮式結(jié)構(gòu)會(huì)向烯醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。其內(nèi)在原理是：首先，羰基氧被酸質(zhì)子化以形成氧正離子化合物，隨后由酸引入的堿基會(huì)去除α-氫，這導(dǎo)致質(zhì)子化羰基的π電子移動(dòng)到氧上，形成烯醇產(chǎn)物的羥基，同時(shí)再生成外加的酸催化劑。

2）在堿性條件下，酮式結(jié)構(gòu)同樣會(huì)向烯醇結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。其內(nèi)在原理是：首先游離的堿基會(huì)進(jìn)攻具有酸性的α-質(zhì)子，這導(dǎo)致羰基的π電子移動(dòng)到α-碳上形成氧負(fù)離子化合物，隨后結(jié)合質(zhì)子，形成烯醇產(chǎn)物的羥基，同時(shí)再生成外加的堿催化劑。

3）在多數(shù)情況下，酮式結(jié)構(gòu)比烯醇式結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的偶極距，故此，強(qiáng)偶極溶劑（也可叫做極性非質(zhì)子溶劑，常用的有DMSO、DMF）有利于酮式結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，有助于烯醇結(jié)構(gòu)向具有高偶極矩的酮式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[1-3]?？紤]到液相色譜中DMSO及DMF的強(qiáng)末端吸收以及二者較強(qiáng)的溶解粘度，一般較少應(yīng)用于液相色譜當(dāng)中。

4) 烯醇式結(jié)構(gòu)由于存在羥基，故此，含有氫鍵受體的溶劑（一般含有孤對(duì)電子的原子如氧、氮均為較強(qiáng)的氫鍵受體）有利于烯醇式結(jié)構(gòu)體的穩(wěn)定，有助于酮式結(jié)構(gòu)向烯醇結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[4, 5]。

5）隨著溫度的升高, 烯醇形成分子內(nèi)氫鍵以及分子間的氫鍵作用力減弱，烯醇含量降低 [6]。

基于上述理論知識(shí)，分享如下案例。實(shí)際工作過(guò)程中遇到一個(gè)醛類(lèi)化合物，嘗試如下色譜條件下進(jìn)行分析方法開(kāi)發(fā)。以甲醇-水（30:70）為溶劑；用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（YMC-Triart C18 3.0μm，150mm×4.6mm）；以甲酸-水（1:1000）為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫。流速為每分鐘1.0ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；柱溫箱溫度為45ºC；進(jìn)樣體積為10μl。

線性洗脫梯度程序

目標(biāo)化合物出峰情況如下所示。在不存在溶劑干擾的情況下，目標(biāo)化合物，除了出一個(gè)明顯的尖峰外，緊接著會(huì)出現(xiàn)一個(gè)展寬嚴(yán)重的色譜峰。將該溶液進(jìn)行LC-MS鑒定，結(jié)果顯示尖峰與展寬色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物具有相同的分子量。結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)，推斷二者互為酮式-烯醇式互變異構(gòu)體，且尖峰為烯醇式化合物（具有更強(qiáng)的極性），展寬嚴(yán)重的色譜峰為酮式化合物。

圖1空白溶劑及目標(biāo)化合物色譜圖

為解決這一問(wèn)題，筆者嘗試了兩種解決方案，均得到了較為滿(mǎn)意的結(jié)果。

解決方案1：為力求化合物以烯醇式單峰的形式出現(xiàn)，根據(jù)上文所述的酮式-烯醇互變化合物特性，將溶劑變更為等溶劑強(qiáng)度的乙腈-水-甲酸（50:50:0.1），將流動(dòng)相B變更為乙腈-甲醇-甲酸（50:50:0.1），同時(shí)將柱溫箱溫度變更為20 ºC。減小流動(dòng)相中甲醇的比例（由于存在其他雜質(zhì)選擇性的問(wèn)題不能將流動(dòng)相中甲醇全部替換成乙腈）以及將溶劑同步變更為乙腈的原因是乙腈為氫鍵受體，有利于與烯醇式結(jié)構(gòu)中的羥基形成氫鍵作用從而增加烯醇式結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；在溶劑以及流動(dòng)相B中加入甲酸的原因是酸性體系下有利于酮式結(jié)構(gòu)會(huì)向烯醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化；降低柱溫箱溫度的原因是較低低溫有利于烯醇形成分子內(nèi)氫鍵以及分子間的氫鍵作用力形成，從而增加烯醇式結(jié)構(gòu)體的穩(wěn)定性。變更流動(dòng)相體系后，色譜圖中獲得了單一的尖銳色譜峰，從而問(wèn)題得以解決。

圖2變更色譜條件后目標(biāo)化合物色譜圖

解決方案2：我們知道含肼結(jié)構(gòu)的化合物在酸性條件下可以同醛酮類(lèi)化合物反應(yīng)。其反應(yīng)原理如下所示：

為了規(guī)避酮式-烯醇互變異構(gòu)出現(xiàn)多重峰或異常峰的可能，筆者精密稱(chēng)定5mg的酮式-烯醇互變化合物，用高濃度（一般為試樣濃度的100倍以上）的肼類(lèi)化合物的弱酸性水溶液（可在肼類(lèi)化合物水溶液中加入適量的磷酸）稀釋制成每1ml約含50μg的溶液，于60 ºC下（一般選擇50~80 ºC水浴）衍生20min。由于水合肼或硫酸肼無(wú)紫外吸收，且不會(huì)引入異源雜質(zhì)干擾，故選擇其為衍生化試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示：

圖3化合物衍生后色譜圖

圖4化合物與肼衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)示意圖

由上，采用與上述相同的色譜條件2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，僅在~5.1min出現(xiàn)一個(gè)相對(duì)于酮式和烯醇式極性更強(qiáng)的尖銳的色譜峰，而未出現(xiàn)~8.5min的烯醇結(jié)構(gòu)化合物的色譜峰。故此推測(cè)，在該衍生條件下烯醇式化合物會(huì)全部轉(zhuǎn)化為酮式結(jié)構(gòu)化合物并與肼進(jìn)行衍生，生成在酸性流動(dòng)相體系中極性更強(qiáng)的堿性腙類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

以上僅為筆者的個(gè)人見(jiàn)解，不當(dāng)或錯(cuò)誤之處敬請(qǐng)同行指正。對(duì)于酮式-烯醇互變化合物存在多重峰的異常情況若有更好的解決方式也請(qǐng)同行不吝賜教。

參考文獻(xiàn)

[1] Garland, E. W.; Nibler, J. W.;Shoemaker, D. P. Experimentsin Physical Chemistry, 7th ed. (and earliereditions); McGraw-Hill: New York, 2003; pp 453–461.

[2] Drexler, E.J.; Field, K. W. J. Chem. Educ. 1976, 53, 392–393.

[3] Spyridis, G.T.; Meany, J. E. J. Chem. Educ. 1988, 65, 461–462.

[4] Reichardt, C. Solvents andSolvent Effects in Organic Chemistry, 2nd ed; VCR: New York, 1988; p 2.

[5] Buemi, G.;Gandolfo, C. J. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2 1989, 85, 215–227

[6] 楊曉亮，等，有機(jī)化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2005年第25卷，1279~1282