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我們多數(shù)情況無法直接得出觀測物的具體參數(shù)，需要借助特定的工具、設(shè)備與檢測技術(shù)。對于任何一個檢測技術(shù)，有一個要求是不言而喻的，即它應(yīng)該中立地反映檢測結(jié)果，也就是說它不應(yīng)該改變檢測結(jié)果；但這只是一種理想狀況，或者說是一個假定，真實(shí)情況往往不是如此。

 

高效液相色譜法（HPLC）是藥物分析中常用的一種檢測技術(shù)，經(jīng)常用于研究、監(jiān)控藥物的有關(guān)物質(zhì)、含量測定、特定雜質(zhì)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

 

在使用HPLC分析方法時，很多參數(shù)如溶劑、流動相、進(jìn)樣瓶、液相色譜儀、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等經(jīng)常被默認(rèn)為中立，但是事實(shí)并非如此。

 

1 溶劑

 

對溶劑作用的期望只有用于溶解待測物，但它事實(shí)上對待測物也有許多其他作用，包括但不限于溶劑效應(yīng)、與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，這些作用都很可能使檢測結(jié)果嚴(yán)重偏離真實(shí)值。

 

溶劑效應(yīng)目前已有很充分的論述，本文不再討論，詳細(xì)內(nèi)容請參見拙著《反相色譜中溶劑效應(yīng)的表征、原理及解決方法》。

 

“與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)”分兩種情況：溶劑、溶劑中的微量雜質(zhì)。

 

溶劑與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)一般在溶劑篩選時易被發(fā)現(xiàn)；溶劑中的微量雜質(zhì)與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)則難以被發(fā)現(xiàn)，主要原因有：

 

1)微量雜質(zhì)一般成分不明，無法通過理論分析排除該風(fēng)險；

 

2)不同來源（如生產(chǎn)商不同或保存時間不同）的溶劑微量雜質(zhì)含量不同。

 

由于以上原因，使得溶劑中微量雜質(zhì)對待測物的作用難以評估，因此對于化學(xué)性質(zhì)較為活潑的待測物，筆者建議應(yīng)在方法開發(fā)時充分評估溶劑的風(fēng)險，必要時指定溶劑的等級、生產(chǎn)商。

 

2 流動相

 

在HPLC方法中，流動相的作用除了從固定相中洗脫待測物外，還很有可能與之發(fā)生互相作用，常表現(xiàn)為圖譜上出現(xiàn)新的未知峰，雜質(zhì)的檢測結(jié)果改變等。

 

這種情況大多是意料之外，很難在早期發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常帶來較為嚴(yán)重的后果，如OOS（Out Of Specification，檢驗(yàn)結(jié)果偏差）。

 

以反相色譜為例，一般來說用到的水、甲醇、乙腈等化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，導(dǎo)致上述情況的，多數(shù)是添加劑或添加劑中的雜質(zhì)。

 

HPLC方法流動相中常用的添加劑，主要分為無機(jī)物與有機(jī)物兩大類。相對來說，有機(jī)物的雜質(zhì)譜較為復(fù)雜，較容易發(fā)生上述情況。

 

筆者建議在用到如三氟乙酸、烷基磺酸鹽、烷基胺類等添加劑時，應(yīng)充分評估添加劑對檢測結(jié)果的影響，必要時指定添加劑的等級與生產(chǎn)商。

 

3 進(jìn)樣瓶

 

在實(shí)踐中，進(jìn)樣瓶對檢測結(jié)果的不利影響極容易被忽略，或者極難加以防止。

 

進(jìn)樣瓶對檢測結(jié)果的不利影響，主要表現(xiàn)在污染與降解。

 

重復(fù)使用的進(jìn)樣瓶由于清洗不徹底引入污染，這是常理，不再贅述。很多實(shí)驗(yàn)室為了消除重復(fù)使用污染的風(fēng)險，進(jìn)樣瓶均為一次性使用，然而卻忽略了新采購的進(jìn)樣瓶并非足夠清潔，其中殘留的組分就有可能與活性性質(zhì)較為活潑的待測物發(fā)生作用，生成新的未知物質(zhì)。

 

筆者建議，在方法開發(fā)時應(yīng)對比新進(jìn)樣瓶清洗前后的的檢測結(jié)果，確認(rèn)進(jìn)樣瓶是否需要清洗后使用。

 

4 液相色譜儀

 

某些具有強(qiáng)絡(luò)合作用的待測物，很可能與液相色譜儀的各個組件，如進(jìn)樣器、色譜柱、管路等中的金屬物體發(fā)生強(qiáng)吸附，表現(xiàn)為在儀器上的殘留。

 

對于此類化合物，清洗溶劑與流動相必要時需要加入某些強(qiáng)絡(luò)合劑（如EDTA）將其置換出來，或改變流動相的條件使其不易發(fā)生絡(luò)合作用。

 

在方法開發(fā)期間應(yīng)基于對待測物化學(xué)性質(zhì)的理解，評估其與液相色譜儀作用的風(fēng)險，采取必要的應(yīng)對措施，不能簡單地默認(rèn)液相色譜儀的中立地位

 

5 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

 

可能影響HPLC分析方法的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素，主要是光、熱、氣三個方面。這些都很容易被忽略或者被默認(rèn)中立。

 

光照包括從窗戶射入的日光以及實(shí)驗(yàn)室照明光。在方法開發(fā)期間，應(yīng)評估日光、實(shí)驗(yàn)室光照對溶液穩(wěn)定性的影響，必要時說明溶液制備、貯存時與光照有關(guān)的注意事項(xiàng)。

 

對于室溫控制較差，波動較大的實(shí)驗(yàn)室，在方法開發(fā)期間應(yīng)充分評估溫度對待測物的溶液穩(wěn)定性、溶解性的影響，如研究較高溫度30攝氏度的溶液穩(wěn)定性，較低溫度15攝氏度的溶解性等。

 

必要時，在方法開發(fā)期間應(yīng)評估實(shí)驗(yàn)室揮發(fā)性組分的風(fēng)險，以避免揮發(fā)性污染物通過空氣交叉污染導(dǎo)致的檢測結(jié)果異常。

 

本文僅列舉數(shù)個常見的、易被忽略的“非中立”參數(shù)，試圖探討如何合理的評估HPLC分析方法潛在的風(fēng)險，并非已包含所有的可能性——

 

風(fēng)險是無限的、資源有限的，這是我們做研究工作的主要矛盾。

 

如何應(yīng)對這種矛盾，需要我們一起認(rèn)真思考。