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車前子是中醫(yī)常用的利尿通淋藥，《中國藥典》2020年版車前子項(xiàng)下含量測(cè)定要求檢測(cè)毛蕊花糖苷，且含量不低于0.4%[1]。研究表明車前子中毛蕊花糖苷會(huì)受溫度、加熱時(shí)間、pH等影響而發(fā)生變化[2-6]。谷彩梅等[2]分析了車前子鹽炙品與生品，發(fā)現(xiàn)炮制后的車前子中毛蕊花糖苷含量升高，同時(shí)鹽炙品中異毛蕊花糖苷含量變化顯著。田偉等[3]發(fā)現(xiàn)車前子中的毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量隨煎煮時(shí)間、溫度、pH值的變化發(fā)生一定程度的變化，推測(cè)毛蕊花糖苷可能發(fā)生酯鍵斷裂生成咖啡酸，并部分轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷。本實(shí)驗(yàn)以毛蕊花糖苷為研究對(duì)象，深入研究pH對(duì)毛蕊花糖苷穩(wěn)定性的影響，明確其變化規(guī)律及可能的轉(zhuǎn)化機(jī)制。

 

毛蕊花糖苷是車前子中主要的苯乙醇苷類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，為連接咖啡?；谋揭掖级擒铡，F(xiàn)代藥理研究表明，毛蕊花糖苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，能修復(fù)阿爾茨海默病的受損神經(jīng)元，改善學(xué)習(xí)和記憶功能[7-9]；能通過抑制間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（c-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）的表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲起到殺死腫瘤的作用[10]；此外毛蕊花糖苷還具有抗炎[11]、抗氧化[12]、抗病原微生物[13]等作用。毛蕊花糖苷在植物中廣泛存在，其毒性小、生物活性多樣，因而具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。但毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)酚羥基，易被氧化，化學(xué)穩(wěn)定性較差，限制了它的臨床應(yīng)用。為了進(jìn)一步探索毛蕊花糖苷的降解特征和降解途徑，本研究采用高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）和高分辨質(zhì)譜（HPLC-IT-TOF-MS）技術(shù)分析了毛蕊花糖苷在不同pH溶液中加熱降解速率，并鑒定了降解產(chǎn)物，初步闡明了其降解規(guī)律。

 

 

1、材料與儀器

 

1.1儀器

 

Prominence型超快速高效液相色譜離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括LC-20AD型二元泵，SLI-20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A型柱溫箱，SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司），安捷倫1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），XS205DU型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），ST16R型冷凍離心機(jī)（美國賽默飛世爾公司），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國密理博公司），KQ-500DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SevenEasy S20 pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

 

1.2藥品與試劑

 

毛蕊花糖苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)19082201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）、異毛蕊花糖苷（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq20050603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.3%）、磷酸二氫鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20190904，分析純）、無水磷酸氫二鈉（天津市威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司，批號(hào)20140411，分析純）、冰乙酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20200301，色譜純）、甲醇（默克公司）、實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備超純水。

 

2、方法與結(jié)果

 

2.1色譜條件[1]

 

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（150mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.5%醋酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～40min，5%～60%B；40～50min，5%B）；檢測(cè)波長為254nm，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為30℃，體積流量為1mL/min。

 

2.2質(zhì)譜條件

 

采用電噴霧電離離子源（ESI），正離子模式掃描，正離子模式下噴霧電壓設(shè)定為4.5kV，一級(jí)、二級(jí)離子掃描范圍均為m/z100～800，采用三氟乙酸鈉作為校正液，霧化氣為氮?dú)猓w積流量為1.5mL/min，碰撞誘導(dǎo)解離能量50%；曲型脫溶劑管溫度200℃，離子累積時(shí)間為30ms，檢測(cè)器電壓1.75 kV。

 

2.3溶液配制

 

2.3.1毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液。稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加20%甲醇水溶解，并定容至刻度，搖勻，制成0.2mg/mL的對(duì)照品溶液。

 

2.3.2異毛蕊化糖苷對(duì)照品溶液。稱取異毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加20%甲醇水溶解，并定容至刻度，搖勻，制成0.2mg/mL的對(duì)照品溶液。

 

2.3.3磷酸緩沖液。分別稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉適量，以水為溶劑，配制pH5、6、7的磷酸緩沖溶液。

 

2.4毛蕊花糖苷降解實(shí)驗(yàn)

 

精密量取“2.3.1”項(xiàng)毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液，分別與pH5、6、7磷酸緩沖液混勻（2∶1），振蕩搖勻后于沸水浴中反應(yīng)，按0、30、60、90、120、150、180、210、240、300min時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取反應(yīng)液500μL于1.5mL離心管中，離心（12000r/min，10min），取上清液于2 mL棕色液相小瓶中。

 

2.5毛蕊花糖苷降解規(guī)律分析

 

對(duì)“2.3.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)樣品，采用HPLC技術(shù)進(jìn)行分析，色譜圖見圖2。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，每個(gè)取樣點(diǎn)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制其在加熱過程中變化規(guī)律，見圖3。從圖3可見，pH值越高，毛蕊花糖苷降解速度越快。其中pH5時(shí)毛蕊花糖苷降解緩慢，pH7在90min時(shí)毛蕊花糖苷幾乎全部降解；異毛蕊花糖苷在pH5時(shí)，其含量呈升高趨勢(shì)，隨pH升高后，其含量先升高后降低，說明毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在接近中性的水溶液中容易降解，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷適合在低pH條件下保存。在不同pH條件下，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷二者總含量均在降低，推測(cè)毛蕊花糖苷在降解過程中，生成異毛蕊花糖苷和其他降解產(chǎn)物，異毛蕊花糖苷在較高pH值還會(huì)繼續(xù)降解成其他產(chǎn)物。

 

 

圖片pH5、6、7條件下毛蕊花糖苷的降解動(dòng)力學(xué)擬合見圖4。毛蕊花糖苷在pH 5時(shí)降解方程為y＝0.002x＋0.0054，R2＝0.9991；在pH6時(shí)降解方程為y＝0.013x＋0.28，R2＝0.9883；在pH7時(shí)降解方程為y＝0.1826x＋0.327，R2＝0.8651；毛蕊花糖苷−ln（Ct/C0）與t的關(guān)系函數(shù)斜率即pH 5、6、7中毛蕊花糖苷的反應(yīng)速率常數(shù)k呈增長趨勢(shì)，且pH5、6中毛蕊花糖苷−ln（Ct/C0）與t的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均接近1，可見相關(guān)性很好，降解反應(yīng)屬于一級(jí)反應(yīng)；pH7降解速率較快，數(shù)據(jù)較少，R2為0.8651。pH5、6、7條件下毛蕊花糖苷的降解半衰期分別為346.5、51.9、3.73min。隨pH值增加，毛蕊花糖苷的降解反應(yīng)速率增大，半衰期減小。通過分析毛蕊花糖苷在不同pH條件下降解反應(yīng)常數(shù)及其半衰期，提示在低pH條件下毛蕊花糖苷穩(wěn)定下較好，適合在低pH條件下保存。

 

 

2.6降解產(chǎn)物的HPLC-IT-TOF-MS鑒定

 

對(duì)“2.3.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)樣品，采用HPLC-IT-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行分析。典型樣品的總體離子流圖見圖5，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間、質(zhì)荷比及裂解規(guī)律信息推斷化合物結(jié)構(gòu)。毛蕊花糖苷降解產(chǎn)物的HPLC-IT-TOF-MS信息見表1。

 

 

2.6.1毛蕊花糖苷原形。峰15，保留時(shí)間為26.245min，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z642.2381[M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H36O15，誤差為−2.6×10−6，峰15與毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷相對(duì)分子質(zhì)量相同；在MSE質(zhì)譜圖中，主要碎片有脫去1羥基酪醇（C8H10O3，154）的碎片m/z471.1515 [M＋H－NH4－C8H10O3]+以及脫去1鼠李糖基的（C6H10O4，146）碎片m/z325.0918[M＋H－C8H10O3－C6H10O4]+，可能的裂解規(guī)律見圖6。通過與毛蕊花糖苷對(duì)照品比對(duì)，鑒定峰15為毛蕊花糖苷。

 

 

2.6.2異構(gòu)化產(chǎn)物。峰19，保留時(shí)間為28.412min，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z642.2379[M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H36O15，誤差為−3.0×10−6，峰19與毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷相對(duì)分子質(zhì)量相同；在MSE質(zhì)譜圖中，主要碎片離子m/z625.2115[M＋H]+，m/z471.1500[M＋H－C8H10O3]+，m/z325.0933[M＋H－C8H10O3－C6H10O4]+，同峰15的裂解規(guī)律相同，通過與異毛蕊花糖苷對(duì)照品比對(duì)，鑒定峰19為異毛蕊花糖苷。

 

2.6.3水解產(chǎn)物。毛蕊花糖苷在加熱過程中發(fā)生水解反應(yīng)，可能水解掉咖啡?；?、鼠李糖基、羥基酪醇等結(jié)構(gòu)，水解產(chǎn)物包括峰6、7、8。

 

峰6，保留時(shí)間為11.645min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z480.2090[M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C20H30O12，誤差為1.9×10−6，峰6相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了1咖啡?；–9H6O3，162）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去一羥基酪醇（C8H10O3，154）產(chǎn)生的碎片m/z309.1129 [M＋H－C8H10O3－NH4]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰6為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷水解掉一咖啡?；–9H6O3，162）的產(chǎn)物，其可能的裂解規(guī)律見圖7。

 

峰8，保留時(shí)間為12.812min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z506.1846[M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C21H28O13，誤差為−2.3×10−6，峰8相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了1羥基酪醇（C8H10O3，154）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去1咖啡?；–9H6O3，162）產(chǎn)生的碎片m/z325.0907[M＋H－C9H6O3]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰8為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷水解掉1羥基酪醇（C8H10O3，154）的產(chǎn)物，其可能的裂解規(guī)律見圖8。毛蕊花糖苷在加熱過程中生成的水解產(chǎn)物還包括峰7、10、18，其可能的結(jié)構(gòu)見圖9。

 

 

2.6.4氧化產(chǎn)物。研究[14-15]表明，鄰苯酚類化合物在過量氧存在時(shí)會(huì)發(fā)生自氧化，生成相應(yīng)的半醌或醌類化合物。毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中均有2個(gè)鄰苯酚存在，在過量氧存在時(shí)，發(fā)生自氧化。由于結(jié)構(gòu)中鄰苯酚位置不同，因此氧化產(chǎn)物不同，分別為峰9、10、12、14、16和18。

 

峰9，保留時(shí)間為16.912min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z654.2008[M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H32O16，誤差為−5.2×10−6，峰9相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了4個(gè)H（4H）、加了1羥基（OH）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去1鼠李糖基（C6H10O4，146）產(chǎn)生的碎片m/z491.1183[M＋H－NH4－C6H10O4]+，再脫去1咖啡?；–9H6O3，162）產(chǎn)生的碎片m/z329.0622[M＋H－NH4－C6H10O4－C9H6O3]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰9為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷2個(gè)鄰苯酚羥基均被氧化的產(chǎn)物，其可能的裂解規(guī)律見圖10。

 

 

峰12，保留時(shí)間為22.612min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z640.2231[M＋NH4]+，推測(cè)的分子式為C29H34O15，誤差為−1.6×10−6，峰12相對(duì)于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷少了2個(gè)H（2H）碎片；在MSE質(zhì)譜圖中，可見脫去1鼠李糖基（C6H10O4，146）產(chǎn)生的碎片m/z477.1374[M＋H－NH4－C6H10O4]+，再脫去1咖啡?；–9H6O3，162）產(chǎn)生的碎片離子為m/z315.0853[M＋H－NH4－C6H10O4－H2O－C9H6O3]+，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷峰初步推測(cè)峰12為毛蕊花糖苷或異毛蕊花糖苷鄰苯酚羥基被氧化的產(chǎn)物；峰12、14和16有相同碎片和裂解規(guī)律，推測(cè)三者可能是同分異構(gòu)體，其可能的裂解途徑見圖11。

 

 

2.6.5其他類。毛蕊花糖苷在加熱過程中發(fā)生水解、氧化反應(yīng)，還可能發(fā)生聚合、還原等其他反應(yīng)。峰4準(zhǔn)分子離子峰為m/z171.0294[M＋H]+，推測(cè)的分子式為C7H6O5，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷及參考文獻(xiàn)報(bào)道[16]，鑒定峰4為沒食子酸。圖12為推測(cè)峰4、11、13可能的結(jié)構(gòu)。

 

峰11，保留時(shí)間為21.245min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z513.1605[M＋H]+，誤差為0.4×10−6，推測(cè)峰11可能是由毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中鄰苯酚羥基發(fā)生氧化，再失去1苯二酚（C6H6O2，110）產(chǎn)生的化合物C23H28O13。峰13，保留時(shí)間為23.212min，準(zhǔn)分子離子峰為313.0704[M＋H]+，誤差為−0.9×10−6，推測(cè)峰13可能是由碎片咖啡酸（C9H8O4，180）和羥基酪醇（C8H10O3，154）結(jié)合生成的化合物C17H12O6。圖13為峰11、13可能的生成途徑。

 

 

3、討論

 

多酚中特殊的多酚羥基結(jié)構(gòu)，尤其是鄰位酚羥基，在堿性條件下容易氧化，使多酚的應(yīng)用受到了很大的限制[17-18]。毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中存在4個(gè)酚羥基，在不同pH條件下，毛蕊花糖苷存在不同程度的降解。在弱酸性條件下，毛蕊花糖苷溶液降解緩慢；在pH7條件下其降解加快，且在90min時(shí)幾乎全部降解。Zhou等[19]研究表明在常溫條件下，毛蕊花糖苷水溶液在pH5條件下比在pH9條件下穩(wěn)定，降解速率慢，高pH降解速率加快。此研究結(jié)論與本研究結(jié)果一致，但本研究還鑒定了其降解產(chǎn)物，并對(duì)降解途徑做了系統(tǒng)的推測(cè)，見圖14。毛蕊化糖苷降解可能的途徑包括異構(gòu)、水解、氧化等。研究結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷可部分降解為異毛蕊花糖苷，毛蕊花糖苷與生成的異毛蕊花糖苷繼續(xù)發(fā)生水解及氧化等降解反應(yīng)，異毛蕊花糖苷含量在pH較高時(shí)呈先升高再降低趨勢(shì)，水解與氧化降解的比例隨pH升高增加。

 

 

田偉等[3]的研究顯示，車前子煎煮過程中毛蕊花糖苷含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，且隨時(shí)間的增加，其含量繼續(xù)降低，異毛蕊花糖苷含量在煎煮過程中呈增加的趨勢(shì)。本研究前期對(duì)車前子水煎液的pH進(jìn)行了測(cè)定，其pH值為6.2，介于本試驗(yàn)考察的pH6與7條件之間，推測(cè)車前子水煎液中毛蕊花糖苷的變化規(guī)律可能與本研究結(jié)果相似。毛蕊花糖苷的降解產(chǎn)物可能在車前子水煎液存在并發(fā)揮藥效，提示應(yīng)關(guān)注車前子、地黃、肉蓯蓉等含毛蕊花糖苷藥材的煎液中毛蕊花糖苷的降解產(chǎn)物。

 

本研究結(jié)果顯示毛蕊花糖苷在弱酸性條件向異毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化率較高。現(xiàn)代藥理研究表明，毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用[20]；毛蕊花糖苷具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]，異毛蕊花糖苷可能通過上調(diào)神經(jīng)型尼古丁受體亞單位蛋白來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]，毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷均具有抗氧化作用[22]；毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷具有相似的藥理活性，因此建議開展毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷相關(guān)藥效等效性試驗(yàn)，明確二者藥效關(guān)系。

 

本研究探討了影響毛蕊花糖苷穩(wěn)定性的因素并對(duì)其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，為毛蕊花糖苷提取、純化及車前子、地黃、肉蓯蓉等富含毛蕊花糖苷的中藥的質(zhì)量控制提供了參考。