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化妝品風險物質篩查檢測技術研究與應用

 

Research and Application of Screening and Detection Technology for Cosmetics Risk Substance

 

摘要

Abstract

 

化妝品安全風險物質主要包括化妝品中禁用物質以及禁用物質的類似物、衍生修飾物，同時還包括環(huán)境污染物等外源性風險化合物。本文介紹了化妝品風險物質篩查檢測技術的研究與應用現(xiàn)狀，旨在推進化妝品安全風險物質檢測技術的完善與提升，及時發(fā)現(xiàn)化妝品潛在安全問題和隱患，保障消費者的合法權益，從而促進我國化妝品安全水平得到整體提升。

 

Risk substances in cosmetics mainly include prohibited substances and their analogs, derivative modifications, and exogenous risk compounds such as environmental pollutants. This paper introduces the research on and application of screening and detection technology for risk substances in cosmetics. By promoting improvement of screening and detection technology for cosmetics risk substances, we aim to uncover potential safety issues in time, so as to protect consumers and improve the overall safety level of cosmetics.

 

關鍵詞

Key words

 

化妝品；風險物質；靶向風險物質篩查；非靶向風險物質結構鑒定

 

cosmetics; risk substances; targeted risk substance screening; structural identification of non-targeted risk substances

 

隨著消費者對化妝品的需求日益增長，化妝品的安全日漸被大眾重視。非法添加藥物及禁用組分是造成化妝品安全問題的重要因素。禁用組分是指不得作為化妝品原料使用的物質?！痘瘖y品安全技術規(guī)范》（2015 年版）中列入的禁用組分共1393種，其中化妝品禁用原料1284 種，化妝品禁用植（動）物原料109 種。傳統(tǒng)檢測方法已無法滿足安全風險物質的檢測要求，為提高化妝品安全監(jiān)管效率，擴大風險物質檢驗范圍，高通量快速篩查檢測技術應運而生[1-6]，突破了現(xiàn)有檢測方式的局限性，加大了非法添加禁用組分的篩查維度。隨著化妝品安全隱患的不斷隱蔽化，出現(xiàn)了非法添加禁用組分外的風險物質現(xiàn)象，如添加禁用組分的衍生物，甚至出現(xiàn)添加經(jīng)修飾合成的風險化合物以規(guī)避監(jiān)管的現(xiàn)象，因此，化妝品未知風險物質的篩查鑒定技術也急需建立完善，及時應對瞬息萬變的安全隱患。

 

1 化妝品高通量靶向風險物質篩查檢測技術

 

針對化妝品中禁限用物質、經(jīng)濟利益驅動非法添加、污染、衍生性效應物質等情況，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱：中檢院）建立了化妝品安全風險物質高通量篩查檢測技術，積極開展化妝品禁限用及其他風險物質高通量篩查集成方法的研究及應用，綜合我國和國際標準、法規(guī)，以及新發(fā)現(xiàn)的污染物和衍生性效應物質等，優(yōu)化整合化妝品膏霜乳、液體、凝膠、粉劑、塊狀、泥、蠟基、噴霧劑、氣霧劑等各類基質的前處理技術，建立了激素類物質、抗感染類藥物、抗組胺類藥物、抗角質化類藥物、解熱鎮(zhèn)痛類藥物、腎上腺素類藥物、麻醉類藥物、精神類藥物、防腐劑、著色劑、熒光增白劑、包裝遷移物、N- 亞硝胺類化合物、有機溶劑殘留、農(nóng)藥殘留、前列腺素及其類似物、致敏性香料、全氟化合物等內容全面的化妝品風險物質篩查庫。樣品進樣后得到各化合物的母離子質荷比、子離子質荷比、保留時間、同位素信息，將檢測樣品中各化合物的母離子質荷比、子離子質荷比、保留時間、同位素信息與建立的風險化合物數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，對安全風險物質進行高通量篩查。下面是實驗室已建立的部分風險化合物數(shù)據(jù)信息。

 

1.1 實驗部分

 

1.1.1 儀器

 

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀（Waters 公司）；Xevo G2 XSQ-TOF 四極桿飛行時間質譜儀（Waters 公司）。

 

1.1.2 試劑

 

乙腈、甲酸銨、甲酸，均為質譜純。

 

1.1.3 標準溶液配制

 

準確稱取各個化合物標準品10mg（精確至0.0001g）至10ml 棕色量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制濃度為1.0mg/ml 的儲備液。

 

分別準確移取各化合物的儲備液10μl 至10ml 量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制濃度為1μg/ml 的混合標準中間溶液。

 

準確移取混合標準中間溶液1ml 至10ml 量瓶中，用水定容至刻度，配制濃度為100ng/ml 的混合標準溶液。

 

1.1.4 樣品制備

 

1.1.4.1 膏霜乳液類、液態(tài)水基類、凝膠類、面膜類樣品

 

稱取樣品0.2g（ 精確到0.001g）， 置于10ml 具塞比色管中，加入少量乙腈，在渦旋混合儀上渦旋混勻，然后加入乙腈至近刻度，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，4000r/min 離心10min，濾過，用等體積乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

 

1.1.4.2 液態(tài)油基類樣品

 

稱取樣品0.2g（精確至0.001g），置于離心管中，加入2ml 正己烷，在渦旋混合儀上分散，然后加入70% 乙腈3ml，渦旋混勻，4000r/min離心10min，吸取下層溶液至10ml 比色管中，上層正己烷層用70% 乙腈3ml，渦旋混勻，4000r/min離心10min，吸取下層溶液至10ml 比色管中，合并兩次溶液，加50% 乙腈定容至刻度，濾過，用等體積乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

 

1.1.4.3 塊狀類樣品

 

稱取樣品0.2g（精確到0.001g），置于10ml具塞比色管中，加入乙腈至近刻度，渦旋混勻，超聲提取20min，乙腈定容至刻度，搖勻，4000r/min離心10min，濾過，用等體積乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

 

1.1.4.4 蠟基類樣品

 

稱取樣品0.2g（精確到0.001g），置于10ml具塞比色管中，加四氫呋喃1ml，渦旋使樣品分散，加乙腈混合溶液（含0.2% 甲酸）至近刻度，渦旋混勻，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈混合溶液（含0.2% 甲酸）定容至刻度，4000r/min離心10min，取上清液0.5ml，加水0.5ml，渦旋混勻，4000r/min 離心10min，取上清液，經(jīng)0.22μm 濾膜濾過，濾液作為待測溶液。

 

1.1.4.5 粉類、泥類樣品

 

稱取樣品0.2g（精確到 0.001g），置于10ml具塞比色管中，加乙腈混合溶液（含0.2% 甲酸）至近刻度，渦旋混勻，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈混合溶液（含0.2% 甲酸）定容至刻度，4000r/min 離心10min，取上清液0.5ml，加水0.5ml，渦旋混勻，4000r/min 離心10min，取上清液，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

 

1.1.5 實驗條件

 

1.1.5.1 UPLC 分離條件

 

進樣體積：3.0μl ；色譜柱：ACQUITYUPLC®BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）；柱溫：40℃ ；流速：0.35ml/min ；正離子模式流動相：A=2mmol/L 甲酸銨水溶液（含0.05% 甲酸），B= 乙腈；負離子模式流動相：A=2mmol/L甲酸銨水溶液，B= 乙腈。UPLC 梯度洗脫程序見表1。

 

 

1.1.5.2 Q-TOF-MS 測定條件

 

電噴霧離子源條件：離子極性：ESI+/- ；毛細管電壓：1kV ；離子源溫度：120℃ ；采樣錐孔電壓：20V ；脫溶劑溫度：550℃ ；錐孔氣流：50L/h ；脫溶劑氣流：1000L/h ；低碰撞能量：4eV ；高碰撞能量：15~50eV ；質量掃描范圍：50~1200m/z ；實時校正液：亮氨酸腦啡肽溶液（200pg/μl）。

 

1.2 結果與討論

 

化妝品風險物質篩查分析流程見圖1。建立的風險物質篩查數(shù)據(jù)庫中每一個化合物條目包含中文名、英文名、化學結構、分子式、平均分子量、單同位素精確分子量、CAS 號等基本信息。此外，每個化合物還具有關鍵定性信息：保留時間及高分辨二級碎片。篩查庫中保留時間對應推薦的色譜條件，二級碎片信息對應推薦的碰撞能量。非數(shù)據(jù)依賴型采集模式，由“低碰撞能”和“高碰撞能”2種掃描交替構成，有效進行高低能量譜圖的匹配，降低假陽性。一針進樣同時獲得一級二級高分辨質譜信息，保留了數(shù)據(jù)的完整性，后續(xù)需要增加篩查目標時，不需再次處理樣品和進樣，重新分析已有的全掃描數(shù)據(jù)即可進行分析。

 

 

1.2.1 抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)庫的建立

 

抗感染類藥物與激素類化合物憑借其快速消炎止癢及使皮膚光滑細膩的假象，一直是實驗室化妝品非法添加物篩查的工作重點[7]?，F(xiàn)有標準檢驗方法包含的化合物數(shù)量有限，無法涵蓋風險物質的種類。實驗室建立的方法通過色譜- 高分辨質譜聯(lián)用技術對抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)庫進行逐步擴充，并以基質加標樣品進行數(shù)據(jù)庫驗證。樣品進樣后得到各化合物的母離子質荷比、子離子質荷比、保留時間、同位素信息，將檢測樣品中各化合物的母離子質荷比、子離子質荷比、保留時間、同位素信息與數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，通過平臺計算打分對含有的安全風險物質進行定性篩查；將經(jīng)篩查確證為陽性的樣品，構建標準曲線，計算安全風險物質的含量。部分抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)信息見表2。

 

 

在激素類化合物中，有多組化合物互為同分異構體，尤其是分離難度大的順反異構體及差向異構體。同分異構體在本實驗條件下可得到良好的分離，圖2 為部分激素類化合物同分異構體的分離效果。

 

 

1.2.2 致敏性香精香料化合物數(shù)據(jù)庫的建立

 

香精香料能夠賦予化妝品愉悅的氣味，掩蓋產(chǎn)品基質的氣味，使化妝品散發(fā)出產(chǎn)品獨特的芬芳。然而隨著香精香料的不斷應用與發(fā)展，呈現(xiàn)的安全問題也日漸被關注。香精香料引發(fā)的化妝品安全事件中，最具代表性的為化妝品過敏。因致敏性香精香料而引發(fā)的過敏案例占化妝品過敏案例的1/3 以上。歐盟規(guī)定了常見的26 種致敏性香精香料的使用限值。目前常見的檢測方法大多僅包含歐盟規(guī)定的26 種化合物，對于化妝品風險致敏性香精香料的覆蓋是遠遠不夠的。實驗室對致敏性香精香料化合物數(shù)據(jù)庫進行擴充，部分致敏性香精香料化合物數(shù)據(jù)信息見表3。

 

 

其中，歐前胡素與異歐前胡素互為同分異構體，在本實驗條件下可得到良好的分離，見圖3。

 

 

4- 甲氧基香豆素，6- 羥基-4 甲基香豆素和4- 羥基-7- 甲基香豆素互為同分異構體，在本實驗條件下可得到良好的分離，見圖4。

 

 

1.2.3 麻醉類化合物數(shù)據(jù)庫的建立

 

化妝品中常見的非法添加麻醉類藥物多為普魯卡因等具有局麻效果的物質，《化妝品安全技術規(guī)范》（2015 年版）化妝品禁用組分列表羅列了普魯卡因等具有局麻效果的化合物，并建立了相應的檢測方法。現(xiàn)已報道的檢測方法也多為此類局麻物質。然而除此類局麻物質之外，《化妝品安全技術規(guī)范》（2015 年版）化妝品禁用組分列表第956 條“麻醉藥類（凡是中國藥政法規(guī)定管制的麻醉藥品品種）”。此類化合物在日常檢測中常被忽視。實驗室對局麻類藥物之外的麻醉類化合物數(shù)據(jù)庫進行了不斷地擴充，部分麻醉類化合物數(shù)據(jù)信息見表4。

 

 

其中，互為同分異構體的氫嗎啡酮和去甲可待因，在本實驗條件下可得到良好的分離，見圖5。

 

 

1.2.4 全氟化合物數(shù)據(jù)庫的建立

 

全氟化合物是一類具有疏水結構的物質[8]，憑借此結構使其理化性質獨特，廣泛應用于化妝品中。研究表示，長期接觸全氟化合物會加大患病風險。我國生態(tài)環(huán)境部等11 個部委于2019 年聯(lián)合發(fā)布《關于禁止生產(chǎn)、流通、使用和進出口林丹等持久性有機污染物的公告》，規(guī)定“自2019 年3 月26日起，禁止全氟辛基磺酸及其鹽類和全氟辛基磺酰氟除可接受用途外的生產(chǎn)、流通、使用和進出口”。實驗室隨即開展全氟辛基磺酸檢測方法的研究建立，并在此基礎上對全氟化合物數(shù)據(jù)庫進行擴充，全氟化合物數(shù)據(jù)信息見表5。

 

 

1.2.5 前列腺素類化合物數(shù)據(jù)庫的建立

 

比馬前列素作為治療青光眼專用藥物[9]，具有促進睫毛生長的副作用，被不良企業(yè)添加到睫毛精華中，以求取得利潤，實驗室展開了前列腺素類化合物及其類似物檢測方法的制定，不斷擴充至化妝品風險物質篩查數(shù)據(jù)庫，表6 為擴展前列腺素類化合物數(shù)據(jù)信息。

 

 

此外，對于歐盟新規(guī)定的化妝品中禁止添加的前列腺素類化合物也隨即開展篩查數(shù)據(jù)的建設，見表7。

 

 

1.2.6 實驗室日常監(jiān)測工作中篩查風險化合物應用舉例

 

實驗室在日常監(jiān)測工作中篩查出化合物應用舉例見圖6。通過一級質譜精確質量數(shù)、二級譜圖碎片離子比對、保留時間、同位素豐度比等信息，與數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，篩查樣品中含有的風險化合物。

 

圖6 為應用實例，通過對一級質譜篩查出的可疑風險物質進行一級同位素分布和母離子精確質量數(shù)匹配分析，再對二級碎片豐度比和精確質量數(shù)進行匹配，主要碎片均與結構完全匹配，碎片的精確質量數(shù)偏差小于0.001Da，并結合匹配得分值判斷樣品中含有克霉唑。

 

 

2 化妝品非靶向風險物質篩查鑒定技術

 

隨著化妝品非法添加向衍生修飾及合成的方向發(fā)展，化妝品非靶向風險物質的篩查鑒定技術急需出臺。中檢院在成功完成非法添加未知物的檢測鑒定任務中，初步建立了化妝品未知風險物質篩查鑒定流程。首先通過查找相關文獻和輿情報道，分析可能添加的可疑風險物質類型。接下來進行可疑化合物掃描分析，采用限制條件對可疑化合物進行篩選。分子式歸屬時需滿足分子元素組成、不飽和度、精確分子質量誤差。通過限制條件減少潛在分子離子峰的數(shù)目。對二級質譜圖進行解析，推測該化合物可能的分子結構。通過在線網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫中的次級結構檢索和分子式檢索獲得相關母體化合物信息。搜索母體化合物的功效和輿情信息進一步驗證推測結構的可能性。利用不同色譜分離系統(tǒng)，對樣品進行初步純化、富集，采用中、高壓制備色譜進行制備，得到單體化合物。通過高分辨質譜對單體化合物進行測定，得到其準確分子式。利用一維和二維核磁共振波譜對單體化合物進行測定，得到化合物的化學結構式[10-13]。圖7 為實驗室在成功完成非靶向化合物非法添加案例中建立的檢驗方法流程。

 

 

3 結論

 

化妝品中可能存在的風險物質包括激素類化合物、抗感染類藥物等非法添加風險物質及外源性風險物質。目前，為了逃避監(jiān)管，已出現(xiàn)添加風險物質的結構類似物及衍生物現(xiàn)象。為了全面篩查風險物質，保障消費者用妝安全，中檢院建立了化妝品風險物質篩查平臺，在風險監(jiān)測實際工作應用中，平臺對激素類化合物、抗感染類藥物、抗組胺類藥物、致敏性香精香料、前列腺素類化合物等非法添加都進行了有效的篩查分析，起到了靶向風險物質的廣泛篩查效果。針對非靶向風險物質，中檢院也初步建立了相應的篩查鑒定流程，并且在兒童化妝品非法添加本維莫德事件中，得到了良好應用。中檢院在健全完善靶向風險物質篩查數(shù)據(jù)庫的同時，不斷提升非靶向風險物質篩查技術，為保障化妝品安全提供了技術支撐。