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嘉峪檢測網 2022-06-15 14:18
1生物標記物介紹
1 生物標記物的定義
“生物標志物”一詞最早出現(xiàn)在1947年關于胎球蛋白Ａ檢測方法的論文中[1]，是一種客觀測量并評價正常生物過程、病理過程或對藥物干預反應的指示物，也是生物體受到損害時的重要預警指標。它涉及細胞分子結構和功能變化，生化代謝過程變化，生理活動異常表現(xiàn)以及個體、群體或整個生態(tài)系統(tǒng)的異常變化等[2]。小分子、蛋白類、細胞、組織學、放射成像或生理學特征等都是生物標志物的類型。比如：傳統(tǒng)的生物標志物包括血壓的可測變化、運動后血液中乳酸的濃度水平、糖尿病患者的血糖指標等。細胞中DNA、RNA、代謝產物或蛋白質含量水平在分子層面的具體變化等均可稱為生物標志物。
2生物標記物的分類
根據2016年發(fā)布的BEST（Biomarkers, Endpoints, and other Tools）[3]，生物標志物可分為：安全生物標志物、診斷生物標志物、易感性\風險生物標志物預后生物標志物、反應生物標志物、預測性生物標志物、監(jiān)測生物標志物。比如：血清肌酐可用作安全生物標志物，用于評估患者使用影響腎功能的藥物來監(jiān)測腎毒性；血糖或血紅蛋白A1c（HbA1c）可用作診斷生物標志物，以識別2型糖尿?。―M）患者。
3生物標記物在藥物研發(fā)周期中的作用
生物標志物在藥物開發(fā)的整個周期（藥物發(fā)現(xiàn)、臨床前、臨床到上市）起著重要作用。在藥物發(fā)現(xiàn)階段：用于藥物靶點選擇、明確作用機制；在臨床前階段：可用于劑量選擇、臨床前安全性評估、明確作用機制；在臨床階段：可作為診斷分層、患者選擇、劑量選擇、藥代動力學、安全性評估、療效評估等；在上市階段，可用于陪伴診斷試劑盒、臨床安全性監(jiān)測、臨床有效性監(jiān)測、藥品質量控制等作用[4]。
圖1. 生物標志物在藥物開發(fā)整個周期中的作用
2004年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布《創(chuàng)新／停滯：新醫(yī)療產品的關鍵路徑上的挑戰(zhàn)與機遇》白皮書提出生物標志物是提升新藥研究開發(fā)能力的關鍵因素[5]。在新藥研究開發(fā)過程中，生物標志物可有效提高研究決策，包括藥物劑量、治療時間、實驗設計、風險／效益比、臨床轉化、臨床受試人群的精準選擇等方面，其指導治療性候選化合物早期臨床開發(fā)已被視為降低失敗風險的一種有效手段。生物技術工業(yè)組織（Bio）公布的一份報告顯示，具有生物標志物指導開發(fā)的新藥獲批成功率是沒有生物標志物的３倍。
案例：在Nature子刊的一篇綜述中[6]總結了臨床試驗失敗的幾個主要原因：錯誤的靶點、錯誤的分子、錯誤的結果和錯誤的病人。以上這些問題可以通過生物標志物引導的臨床試驗設計來有效解決，從而提高臨床試驗成功率。比如預測患者分層的生物標志物不僅有助于識別對藥物有高反應的患者，還可以排除對藥物副作用敏感的患者。
個性化治療成功案例之一是基因泰克公司的乳腺癌治療單抗赫賽[7]。Her2是人表皮生長因子受體2，發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代，是腫瘤靶向治療的重要靶點。赫賽汀曲妥珠單抗是一種抗Her2的人源單克隆抗體，可阻斷Her2，破壞下游通道，抑制腫瘤細胞的生長。
眾所周知，Her2在大約20%~30%的乳腺癌患者中過度表達?；蛱┛耸紫乳_發(fā)了赫賽汀的藥物。他們使用靶向Her2作為其預測生物標志物，在臨床試驗期間篩選入組患者。選取Her2表達過高的乳腺癌患者進行臨床試驗。赫賽汀的臨床效率通過僅200名患者的III期臨床研究證明，隨即獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的加速審批獲準上市，如果基因泰克當年沒有采用Her2作為生物標記物來篩選潛在的有效病人，由于只有不到30%的乳腺癌病人有Her2過度表達，只有幾百人的臨床III期試驗結果很可能會失敗。生物標記物在藥物研發(fā)中的作用可見一斑。
CA CANCER J CLIN 2020:70:355-374
圖2. 曲妥珠單抗（赫賽汀，trastuzumab)作用機制
2生物標記物-蛋白類生物標記物的檢測技術
1生物標記物檢測技術
生物標記物涉及小分子、蛋白類、細胞、基因分子、組織切片等。通常可以用不同檢測平臺對不同種類的生物標記物進行測定：如用液質聯(lián)用（LC-MS/MS）檢測小分子類生物標記物（氫化可的松、雌激素、精氨酸）；用配體結合方法（ligand binding assay）測定蛋白類生物標記物（炎癥細胞因子白介素IL-6等）；用流式細胞術（FACS）測定免疫細胞亞群的變化、受體占有率；免疫組織化學IHC用于組織染色（黑色素瘤切片，腫瘤活檢標本腫瘤活檢標本）；q-PCR、dd-PCR用于基因組學生物標志物如（急性缺血性腦卒中：microRNA-27a-3p）等。
圖3. 不同類生物標記物的檢測平臺
2蛋白類生物標記物檢測技術
蛋白類生物標記物，通常使用配體結合方法（ligand binding assay）進行測定，常規(guī)的免疫檢測分析平臺如：酶標儀、電化學發(fā)光反應器MSD、Bio-Plex懸液芯片多重檢測平臺、Simoa全自動單分子免疫檢測儀、Ella全自動微流控免疫學檢測系統(tǒng)、SMCxPRO™單分子免疫檢測平臺等進行檢測。
酶聯(lián)免疫分析（ELISA）是很早被應用于體液樣本臨床蛋白標志物檢測的技術，使用簡單方便，在實驗室應用廣泛，已經使用了幾十年，因而也被當成“金標準”來使用。酶聯(lián)免疫分析類型包括：直接法(Direct ELISA)、競爭法(Competitive ELISA)、間接法( Indirect ELISA ) 和夾心法(Sandwich ELISA)，但是ELISA靈敏度相對有限，線性范圍窄。
電化學發(fā)光反應器（MSD）利用電化學發(fā)光原理，靈敏度高、背景低、線性范圍廣。同時通過每個小孔不同位點包被不同抗體來實現(xiàn)多重檢測，一次可以檢測10個多因子。
Luminex懸液芯片多重檢測平臺使用不同染色微球和流式細胞術原理，可實現(xiàn)同時檢測100個生物標記物。
Simoa全自動單分子免疫檢測儀利用數字PCR檢測原理，將磁珠免疫復合物密封在236000個小孔中反應（每個小孔反應的體積是50飛升），采用數字化的計算方式，可以將檢測靈敏度提高到傳統(tǒng)ELISA的1000倍。
Ella全自動微流控免疫學檢測系統(tǒng)將微流控、自動化檢測、超敏熒光檢測技術整合，徹底顛覆了傳統(tǒng)的ELISA技術，可實現(xiàn)全程自動化、全程自動化、從樣本前處理到結果1.5小時、靈敏度高、檢測范圍寬等優(yōu)點。
其他如Singulex、Gyros、Elispot、Randox等多種免疫檢測平臺用于蛋白類生物標記物的測定。
3“Fit-for-purpose” 方法學開發(fā)和驗證
生物標記物可以在藥物開發(fā)的過程中被科學家和監(jiān)督機構廣泛用于各種目的。這些應用可以從探索性的假設生成，內部決策，到病人篩選或關鍵的臨床決策?？紤]其復雜性，法規(guī)部門并沒有統(tǒng)一的生物標志物方法驗證指南。
1法規(guī)要求
中國藥典和歐洲藥品管理局（EMA）等法規(guī)并沒有明確針對生物標記物的內容[8-9]。FDA在2013年的《生物分析驗證法規(guī)指南》中提到[10]，對于生物標記物可以使用“fit-for-purpose” 的生物分析策略。根據生物標記物應用的目的來確定其生物分析驗證的程度和內容。如果生物標記物的數據將用于法規(guī)部門申報：比如用于安全性或有效性的關鍵決定或者用于支持藥物給藥劑量的指導，那么方法需要做全驗證。對于用于支持早期藥物研發(fā)（候選物選擇、內部決策、概念驗證等），申辦方可以根據需要來選擇合適的驗證內容。工業(yè)界也發(fā)表了不少文章來討論如何進行“fit-for-purpose”的方法驗證，詳細描述了如何進行生物標志物的方法確認或驗證[11]。
2藥明康德生物分析部標準操作規(guī)程
藥明康德生物分析部對于生物標記物方法學驗證有專門的標準操作規(guī)程（SOP）以及最佳實踐指南（Best Practice）來定義如何進行生物標記物方法確認或驗證。通常根據生物標志物的使用目的，分為三個級別：
級別1：非GLP方法的建立，這樣的方法用于探索性的假設生成，樣本檢測的結果不會用于監(jiān)管機構的任何決策。
級別3：方法驗證，這樣的方法是按照生物分析的法規(guī)來驗證所有的參數，樣本檢測的結果將由監(jiān)管機構審核，如評估藥物是否有效的次要終點。
以上三個級別的生物標志物的開發(fā)、確認\驗證具體考察內容如下：
圖5.三個級別的生物標志物的開發(fā)、確認\驗證
對于級別1和級別2的生物標記物的方法學開發(fā)和確認內容，可以根據申辦方的具體要求對考察內容進行一定的調整。
4蛋白類生物標記物生物分析中的挑戰(zhàn)
對于蛋白類生物標記物，通常可以用商品化的試劑盒或自主開發(fā)方法。商品化的試劑盒提供了快速的分析解決方案，操作方便、成本效益較低等，但由于不同供應商提供的試劑盒在方法開發(fā)和驗證的內容以及關鍵試劑的性能把控方面差別很大，可能不足以支持臨床藥物研發(fā)的生物標記物的分析檢測。而且作為商品化的試劑盒廣泛應用于不同種屬和不同基質，并非專門為臨床應用而開發(fā)，因此盡管是商品化的試劑盒，在用于支持臨床樣本分析之前，仍需要做方法開發(fā)和驗證。FDA和EMA的法規(guī)指南[9,10]也指出用于藥物開發(fā)目的商品化試劑盒，仍需要進行驗證以確保方法的可靠性。由于生物標記物的特殊性和復雜性，在方法開發(fā)和驗證中會遇到下面不同的挑戰(zhàn):
1標準品-替代性生物標記物
對于蛋白質生物標志物的定量分析，通常是需要用蛋白質生物標志物的標準品來配制標曲。然而內源性的蛋白質生物標志物是在生物體內天然產生的，具有各種翻譯后修飾的異構體，某種形式的異構體可以隨疾病狀態(tài)、遺傳學、性別、年齡等變化[12]。而相反，不同供應商提供的不同標準品 (不同形式的異構體、重組蛋白、融合蛋白等)是純化的、人工合成的，在蛋白序列、純度、糖基化、折疊程度等方面，可能與內源性分析物不同，因此缺乏能夠完整表征內源性分析物的生物標志物標準品，生物標記物分析是相對定量而不是絕對定量。在選擇最能表征內源性生物標記物的標準品時，需要考慮以下幾點：
內源分析物的理化性質 (蛋白質是否以單體形式存在，二聚體、三聚體等)
生物標志物的相關亞型，翻譯后修飾、裂解、剪切等
外源性蛋白的表達系統(tǒng) (如大腸桿菌，昆蟲細胞或真核細胞表達系統(tǒng))
外源性蛋白批次間可能的差異
不同廠家提供標準品的差異
因此最好盡量采用同一廠家、來源、批次的標準品，同時通過平行性實驗考察內源性與替代性生物標記物差異，來確認外源性蛋白是否可以作為替代性生物標記物。
2替代性空白基質
絕大部分的生物標記物都是內源性的，在生物體內可以檢測到，因此標準品不能直接配制到空白的生物基質中，需要使用替代性的空白基質。通?？蛇x下面的三種方式：
內源性低于LLOQ的空白基質，可以直接使用這些空白基質，這種方式的優(yōu)點是基質差異小，處理簡單。
使用去除內源性生物標記物的空白基質，比如：碳粉吸附、水解、親和色譜等處理后的空白基質。優(yōu)點是基質差異小，缺點是內源性生物標記物難徹底清除，處理方式繁瑣、費用高。
使用異源基質（猴血清、幼兒血清）或者人工配置稀釋液（牛血清蛋白）。人工配置稀釋液的優(yōu)點是具有更好的穩(wěn)定性，適合長期使用。缺點是與內源性基質差異比較大，有時在基質效應方面不能模擬真實基質。
目前商品化的試劑盒，通常是人工配置稀釋液（牛血清蛋白）做為空白基質，因此需要做平行性實驗來考察替代性空白基質的可行性。
3 質控QC樣本
在方法驗證和樣本分析過程中，每個分析批都需要放置質控QC樣本。質控QC樣本需要模擬真實樣本，最好使用內源性基質。由于很難找到高中低各個濃度的內源性基質，通常質控QC的配制有以下形式：
直接篩選合適濃度的內源性基質
用稀釋液稀釋后的內源性基質
內源性基質中直接添加標準品
上述質控QC樣本至少需要通過3個批次的實驗來確定濃度，用于方法學驗證。當然對于級別1或級別2的方法學確認，也可在人工配置稀釋液（牛血清蛋白）中添加標準品。一般試劑盒中會有這類質控QC，可以直接用于方法學確認，但是對于級別2的方法學確認，至少一個質控QC需要用內源性基質配制。
4平行性
平行性實驗在生物標記物方法學開發(fā)、驗證中有非常重要的作用，是方法學考察中的一個非常重要的指標。正如前面提到，由于使用了替代性標準品和空白基質，所以需要考察其同內源性生物標記物的平行性。平行性實驗通常在方法開發(fā)階段就要進行考察，一般選取高內源性的多個不同來源的基質，進行1.5-2倍的序列稀釋，并保證至少3-4個稀釋后的濃度在線性范圍之內，通過計算每個稀釋濃度與最少稀釋倍數（MRD）進行比較，80%以上需要滿足回收率在100±20.0%和精密度要在20%之內。通過平行性實驗可以確定MRD，評估分析的靈敏度，觀察不同基質的選擇性。
通?？梢杂媒】凳茉囌叩幕|來考察平行性，如果有些生物標記物在正常健康人中表達低，可以考慮使用病人受試者基質來考察平行性[13-14]。如果病人基質中的濃度也很低，最后可以考慮將標準品配制到空白基質中做序列稀釋，作為平行性實驗的參考。
平行性的失敗通常有兩種情況：不同個體之間基質不平行和內源性基質同標曲不平行。不同個體之間基質不平行，可能是基質效應或者選擇性問題引起。而內源性基質同標曲不平行，可能需要考慮更換標準品或者關鍵試劑。
5選擇性
在生物標記物分析方法驗證中，考慮到外源性標準品只是替代性的生物標記物，因此選擇性并不是必須要考察的指標。由于生物基質中往往含有內源性的生物標記物，因此選擇性考察，需要采用加量法和減量法的方法來計算回收率。
加量法的計算公式：
減量法的計算公式：
美國藥學科學家協(xié)會（AAPS）的一篇文獻認為減量法相對加量法能夠提供更加可靠的結果，并且建議添加外源性標準品的濃度至少是30%內源性基質濃度[15]。
用加量法和減量法考察選擇性，要求至少80%以上的基質回收率在100±20.0%范圍內。如果不能滿足上述標準，可以通過基質加標后序列稀釋的方法進行選擇性考察。在至少6個批次的生物基質中加入已知量的標準品，進行1.5-2倍的序列稀釋，并保證至少3-4個稀釋后的濃度在線性范圍之內，通過計算每個稀釋濃度與最少稀釋倍數（MRD）進行比較，80%以上需要滿足回收率在100±20.0%以及精密度要在20%之內。
穩(wěn)定性是考察檢測的生物標記物在樣本采集、運輸、分析、儲存過程中的穩(wěn)定性。目前沒有法規(guī)規(guī)定如何檢測生物標記物的穩(wěn)定性。常用有兩種方法：內源性基質（單獨或者混合）的穩(wěn)定性和標準品配置到內源性基質中的穩(wěn)定性[16]。但是標準品配置到內源性基質中的穩(wěn)定性并不能代表真實樣本的基質，不能真正模擬體內生物標記物，比如折疊和翻譯后修飾的差異就可能導致穩(wěn)定性的差異，例如標準品配制的IL-13基質中的穩(wěn)定性只有5個月，而IL-13病人中的穩(wěn)定性是15個月。
但是使用內源性基質來考察穩(wěn)定性也會有問題。樣本的穩(wěn)定性是在不同時間分別測定后進行回收率比較，標準品或者關鍵試劑批號的改變可能會影響結果的測定。另外，疾病狀態(tài)會影響蛋白酶調節(jié)的差異從而引起蛋白折疊的不同，可能也會影響內源性生物標記物的穩(wěn)定性，例如TGF-B在正常人尿液中的凍融穩(wěn)定性要高于病人尿液中的凍融穩(wěn)定性。因此目前有文獻報道可以使用計算機或者統(tǒng)計方法對內源性和配制的質控樣本進行趨勢和統(tǒng)計分析，來考察其穩(wěn)定性。
圖7. 內源性和配制的質控樣本趨勢分析
7多重檢測
隨著技術發(fā)展，MSD、Luminex、Simoa、Ella等儀器平臺都可以實現(xiàn)多重檢測，允許在單個分析中同時測量多個分析物樣本。多重檢測好處：減少實驗室分析時間、降低樣品體積、節(jié)約成本等。但是在方法開發(fā)、驗證以及樣本分析過程中，由于其復雜性也帶來了獨特的挑戰(zhàn)[17]。
定量范圍和最小稀釋倍數的確定：不同分析物的內源性水平不一致，所以樣本的稀釋倍數需要考慮其他分析物的稀釋倍數。不同分析物平行性考察結果，也可能會產生不同的MRD。因此需要對不同化合物進行綜合考慮，選取能夠覆蓋所有化合物的最小稀釋倍數，但可能導致某些靈敏度低的分析物檢測不到。
內源性基質QC的確定：由于不同分析物的內源性基質濃度不一樣，有時很難找到一組合適的內源性基質QC用于所有需測定的分析物，因此需要配制不同組的內源性QC用于多個分析物測定，這樣就降低了多重分析的優(yōu)勢和樣本分析的方法適用性。
穩(wěn)定性：樣品穩(wěn)定性受最不穩(wěn)定的分析物的限制，如果一種分析物高度不穩(wěn)定，建議將其從多因子測定的通道中移除。
不同分析物之間的交叉反應：由于多重檢測具有多個捕獲和檢測抗體對，較單個分析物檢測容易產生交叉反應，尤其是對具有相似的二級、三級結構或相似氨基酸序列的不同分析物，分析物的識別表位可能被其他分析物的抗體所識別，導致錯誤的信號，從而產生交叉反應。
串擾的影響：串擾是指來自單獨分析物的信號可能會對另一種分析物產生影響?？赏ㄟ^配制不同濃度的某種分析物并將其他分析物保持在恒定的低水平濃度以及配制空白樣品，通過信號比較來顯示這種分析物對其他分析物背景信號的影響。如果確實存在串擾的問題，需要考慮更換試劑盒。
批間差異：關鍵性試劑的批間差異容易引起信號的變換。考慮到多重檢測包含更多捕獲和檢測等關鍵試劑，更容易引起試劑盒批件的差異，建議購買足夠數量的試劑盒或試劑進行驗證和樣品分析。如使用新試劑盒，要進行橋接批次的實驗。
參考文獻
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來源：藥明康德測試事業(yè)部
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