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以樹(shù)脂為載體，使用固相合成技術(shù)合成多肽類藥物的技術(shù)現(xiàn)如今已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，如固相合成GLP-1類似物索馬魯肽、利拉魯肽。相比于液相合成多肽，固相合成有其顯著的優(yōu)點(diǎn)：可以使用過(guò)量的物料進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)簡(jiǎn)單的對(duì)肽樹(shù)脂洗滌除去過(guò)量的物料，副產(chǎn)物，避免了中間復(fù)雜的后處理純化過(guò)程，提高效率；可以通過(guò)不同的保護(hù)基對(duì)側(cè)鏈保護(hù)，選擇性脫除，最后實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈的選擇性修飾，如Fmoc策略中使用Mmt、Alloc、ivDde對(duì)Lys氨基側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，可以使用對(duì)應(yīng)的HCl、四三苯基膦，水合肼選擇性脫除側(cè)鏈保護(hù)，最后對(duì)氨基進(jìn)行修飾得到修飾肽。今天我和大家介紹一下氨基酸偶聯(lián)步驟中使用的縮合劑以及使用時(shí)的注意事項(xiàng)

 

HOXT/DIC縮合體系

 

碳二亞胺型縮合體系，出于成本考慮通常使用HOBT/DIC，HOAT/DIC活性更高，抑制消旋作用更強(qiáng)但價(jià)格稍貴。有時(shí)為了防止HOBT爆炸，會(huì)使用水合HOBT，但實(shí)際上使用干的HOBT從未有報(bào)道過(guò)發(fā)生爆炸的情況。這套縮合體系使用最廣泛，因?yàn)榇颂左w系成本低，活化過(guò)程中沒(méi)有堿的參與，可以更好的抑制消旋。值得注意的是Cys在堿性條件下活化時(shí)（如HXTU/DIPEA，PyXop/DIPEA等）特別容易消旋，因此推薦使用HOXT/DIC活化。以HOBT為例，活化機(jī)理見(jiàn)圖a。

 

 

圖a

 

氨基酸先和DIC生成氧酰基異脲中間體，之后和HOXT迅速反應(yīng)生成氨基酸的HOXT活化酯（如果沒(méi)有HOXT，氧?；愲逯虚g體會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化成無(wú)反應(yīng)活性的N-?；愲?，見(jiàn)圖b），高活性的活化酯與氨基縮合成酰胺?；罨^(guò)程中會(huì)有脲副產(chǎn)物生成，如活化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)觀察到活化體系變渾濁就是脲副產(chǎn)物析出，最后可以通過(guò)使用DMF洗滌樹(shù)脂除去。

 

 

圖b

 

使用配方：AA/HOBT/DIC=1/1/1

操作步驟：氨基酸和HOBT溶于工藝選定的溶劑中，控溫下加入DIC活化，活化完成后把活化液加入固相反應(yīng)器反應(yīng)。

 

HXTU/DIPEA縮合體系

 

脲鹽型縮合劑，通常HBTU，HATU配合三級(jí)胺一起使用。這套活化體系反應(yīng)活性優(yōu)于HOBT/DIC體系。一般情況下第一次偶聯(lián)反應(yīng)不完全的情況下可以考慮使用HXTU/DIPEA縮合體系。以HATU為例，活化機(jī)理見(jiàn)圖c。

 

 

圖c

 

這里需要注意一個(gè)副反應(yīng)，過(guò)量的HXTU在堿性條件下會(huì)和氨基組分反應(yīng)發(fā)生胍基化副反應(yīng)，使肽鏈封端。機(jī)理見(jiàn)圖d。產(chǎn)生此副反應(yīng)的原因是HXTU使用過(guò)量，導(dǎo)致剩余的HXTU與氨基反應(yīng)，因此投料時(shí)控制HXTU的量不超過(guò)氨基酸的量；或者HXTU沒(méi)有與氨基酸的羧基反應(yīng)完全就加入固相柱反應(yīng)，因此偶聯(lián)前需要充分活化以避免未消耗的HXTU與氨基發(fā)生副反應(yīng)。

 

 

圖d

 

使用配方：AA/HXTU/DIPEA=1:1:2，有時(shí)可以在其中添加HOXT，如

AA/HXTU/HOXT/DIPEA=1:1:1:2，但沒(méi)有明確的證據(jù)表明添加HOXT能夠提高反應(yīng)效率或者減小消旋。

操作步驟：氨基酸和HXTU溶于工藝選定的溶劑中，控溫下加入DIPEA活化，活化完成后把活化液加入固相反應(yīng)器反應(yīng)。

 

PyXop/DIPEA體系

 

磷鹽型縮合劑，常用PyBop，PyAop配合三級(jí)胺一起使用。高效活化體系，一般情況下第一次偶聯(lián)反應(yīng)不完全的情況下可以考慮使用PyXop/DIPEA縮合體系。比起HXTU/DIPEA，這個(gè)偶聯(lián)劑不會(huì)引起類似的氨基封端反應(yīng)，因此在固相合成中更加受歡迎。但是質(zhì)量差的或存放時(shí)間長(zhǎng)的PyXop中吡咯的含量會(huì)增加，活化時(shí)會(huì)使氨基酸羧基封端生成吡咯酰胺，失去反應(yīng)活性。機(jī)理見(jiàn)圖e

 

 

圖e

 

商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的PyBop會(huì)殘留一些吡咯烷，對(duì)于固相反應(yīng)來(lái)說(shuō)雖然會(huì)導(dǎo)致活性氨基酸的當(dāng)量下降，但吡咯酰胺衍生物不會(huì)引入到肽鏈中，因此副反應(yīng)在固相合成影響不大，但是液相合成或頭尾環(huán)化會(huì)產(chǎn)生影響?？梢酝ㄟ^(guò)再結(jié)晶的方法將膦鹽中的吡咯烷副產(chǎn)物從受影響的物質(zhì)中除去，從而有效地抑制了上述副反應(yīng)。

使用配方：AA/PyXop/DIPEA=1:1:2，有時(shí)可以在其中添加HOXT，如

AA/PyXop/HOXT/DIPEA=1:1:1:2，但沒(méi)有明確的證據(jù)表明添加HOXT能夠提高反應(yīng)效率或者減小消旋。

操作步驟：氨基酸和PyXop溶于工藝選定的溶劑中，控溫下加入DIPEA活化，活化完成后把活化液加入固相反應(yīng)器反應(yīng)。

 

DEPBT/DIPEA 體系

 

磷酸酯型縮合劑，也稱作葉蘊(yùn)華試劑。反應(yīng)活性高，抑制消旋作用優(yōu)于HXTU/DIPEA或PyXop/DIPEA體系，特別能夠抑制His的消旋?；罨瘷C(jī)理見(jiàn)圖f

 

 

圖f

 

Oxyma/DIC 體系

 

2-肟氰乙酸乙酯，使用方法和HOXT一樣，抑制消旋的能力更強(qiáng)。不同的是Oxyma比HOXT酸性更強(qiáng)，因此可以抑制脯氨酸引起的二肽反應(yīng)。脯氨酸氨基為二級(jí)胺，結(jié)構(gòu)與哌啶類似，并且其二級(jí)胺的pKa=10.6，高于普通氨基酸pKa 8.9–9.8，在偶聯(lián)脯氨酸后面的氨基酸時(shí)，裸露的二級(jí)胺可能會(huì)使Fmoc-保護(hù)氨基酸活化酯提前脫除Fmoc，與另一分子Fmoc-保護(hù)氨基酸活化酯縮合生成Fmoc-保護(hù)二肽活化酯，最終導(dǎo)致插入肽雜質(zhì)生成。Oxyma酸性強(qiáng)，能夠抑制脯氨酸二級(jí)胺的堿性，抑制此副反應(yīng)

小結(jié)：

目前應(yīng)用最多的縮合體系是HOXT/DIC，雖然活性不如HXTU/DIPEA和PyXoP/DIPEA，但是由于活化沒(méi)有堿的參與，消旋的情況會(huì)少一些。一般情況下第一次偶聯(lián)使用HOXT/DIC，如果反應(yīng)不完全的話再使用HXTU/DIPEA和PyXoP/DIPEA等高效活化體系復(fù)投。除了上述的幾種常用縮合劑之外，還有很多新型縮合劑，他們?cè)谔岣吲悸?lián)效率，抑制消旋的方面表現(xiàn)突出。如新型脲鹽型縮合劑中HATU的衍生物HCTU、HDTU、TDBTU，脲鹽和Oxyma結(jié)合得到TOTU、HOTU、COMU等。見(jiàn)圖g

 

 

圖g