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［摘要］聚山梨酯20/聚山梨酯80及泊洛沙姆188是抗體藥物制劑處方中常用的穩(wěn)定劑。隨著研究及檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，抗體藥物在放置過程中，蛋白來源的可見異物/不溶性微?？杀粰z測到呈增加趨勢，其起因可能與抗體藥物制劑處方有關(guān)。本文對由制劑處方中聚山梨酯20/聚山梨酯80、泊洛沙姆引起的可見異物/不溶性微粒進(jìn)行原因分析，明確現(xiàn)行指導(dǎo)原則及法規(guī)對可見異物/不溶性微粒的要求。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合藥學(xué)審評實(shí)踐，淺談對抗體藥物制劑處方中的可見異物/不溶性微粒審評的基本考量，以期提高企業(yè)對此類問題的關(guān)注，并為同類產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

抗體藥物是生物制品行業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。既往抗體藥物多以靜脈滴注給藥方式為主，近年來，隨著抗體藥物質(zhì)量研究的深入以及患者依從性需求的提高，注射給藥途徑逐漸趨于主流［1 － 2］。與靜脈滴注給藥相比，注射給藥需要抗體藥物在單位體積內(nèi)濃度更高，這使得抗體藥物中輔料與抗體蛋白作用的概率增加，從而提高了可見異物/不溶性微粒增加的風(fēng)險。

可見異物/不溶性微粒的控制是保證注射劑安全使用的一項(xiàng)重要指標(biāo)，各國藥典對其均有要求［3］，特別是近年來，隨著全生命周期管理理念不斷深入，以 及抗體藥物研究成熟度不斷加強(qiáng)，聚山梨酯20(polysorbate 20，PS20)、聚山梨酯80(polysorbate 80，PS80)、泊洛沙姆188(poloxamer 188，P188) 等抗體藥物處方中常用輔料與抗體蛋白作用而導(dǎo)致可見異物/不溶性微粒數(shù)量發(fā)生變化的現(xiàn)象，以及隨之可能增加的風(fēng)險已被逐漸關(guān)注?！禝CH Q9 Quality Ｒisk Management》明確了質(zhì)量風(fēng)險評估的理念及原則，即質(zhì)量風(fēng)險管理是一個系統(tǒng)的流程，在整個產(chǎn)品生命周期中進(jìn)行質(zhì)量風(fēng)險評估應(yīng)該基于科學(xué)知識并最終與對患者的保護(hù)相結(jié)合［4］。本文將結(jié)合審評實(shí)踐及風(fēng)險評估理念，就抗體藥物中蛋白來源的可見異物/不溶性微粒增加問題提出相關(guān)思考，為此類藥物的研發(fā)提供參考。

一、可見異物/不溶性微粒增加的原因分析

大多數(shù)蛋白都有形成聚體的傾向，抗體藥物在生產(chǎn)、儲存及運(yùn)輸時都會伴隨緩慢的聚體形成過程，進(jìn)而形成可見異物/不溶性微粒，甚至沉淀，現(xiàn)有技術(shù)已可以較好地解決并避免蛋白聚集的產(chǎn)生。本文將重點(diǎn)介紹由抗體藥物制劑處方中常用輔料與抗體蛋白作用引起的蛋白源性可見異物/不溶性微粒。

PS20，PS80 與 P188 具有良好的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和安全特性，目前已成為生物制品中最常用的表面活性劑［5］。然而，在過去幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，由于此 2 種表面活性劑易發(fā)生化學(xué)降解，隨著時間的推移，在含有該成分的制劑中可觀察或檢測到可見或不可見蛋白性質(zhì)的顆粒［6-8］。

聚山梨酯是異質(zhì)的混合物，容易通過多種途徑降解，如化學(xué)水解、氧化和酶水解。不同途徑之間的降解模式有顯著的不同［9］，降解產(chǎn)物的種類可提示降解作用機(jī)制［10］?；瘜W(xué)水解產(chǎn)生的主要降解產(chǎn)物為游離脂肪酸( free fatty acids，F(xiàn)FAs) ，但在生物制藥相關(guān)條件下不太可能發(fā)生化學(xué)水解［11-12］; 氧化的降解產(chǎn)物包括過氧化物、醛、酮、脂肪酸酯和游離脂肪酸，其中游離脂肪酸為次要降解產(chǎn)物; 酶水解被認(rèn)為是在抗體藥物中聚山梨酯降解導(dǎo)致蛋白聚體微粒形成的根本原因。這些酶( 脂肪酶、酯酶等) 特別是宿主細(xì)胞蛋白殘留中的一種磷脂酶 B2 可以在酯鍵處裂解聚山梨酯，從而形成 FFAs 和游離的基團(tuán)或多元醇，由于 FFAs 在水溶液中溶解度差，當(dāng)溫度為5 ℃ 時，制劑中形成可見或不可見的顆粒，對其蛋白質(zhì)的長期穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響，從而影響藥品的有效期。此外，除了 FFAs 和多元醇之外，PS20 的降解產(chǎn)物還可以包括由高級酯降解引起的單酯，因此酶降解也可以改變?nèi)芤褐袣埩?PS20 的酯分布［13］。因此含聚山梨酯的單抗制劑中蛋白來源的微粒增加是否主要由溶解性較差的 FFAs 蓄積所致，還需研究者根據(jù)具體情況，深入分析及甄別。

P188 不像聚山梨酯易于降解，是可能替代聚山梨酯的表面活性劑，其可有效作用于空氣-水界面， 在各種影響因素條件( 如熱、攪拌、凍結(jié)) 下使抗體藥物穩(wěn)定［14］。但在 2 ℃ ～ 8 ℃ 長期穩(wěn)定性研究中，含有 P188 組分的制劑中可觀察到蛋白質(zhì)與聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 相互作用形成的顆粒，該顆粒往往比純蛋白質(zhì)顆粒要大，這種現(xiàn)象可能與蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)及直接接觸包材有關(guān)，蛋白質(zhì)與 PDMS 之間的相互作用導(dǎo)致含 P188 的制劑中形成微粒。Grapentin 等［15］ 的研究顯示，無 PDMS 的膠塞減少了這種粒子的形成。然而，當(dāng)使用這個特殊的無 PDMS 塞子時，通過 FTIＲ 顯微鏡觀察到氟聚合物粒子。蛋白質(zhì)-PDMS  粒子的形成可能是由不同的因素決定，如 P188 競爭性地吸附到PDMS 界面的能力、系統(tǒng)中 PDMS 的數(shù)量和類型以及蛋白質(zhì)的濃度和分子性質(zhì)等，目前形成蛋白質(zhì)PDMS 顆粒確切的相關(guān)機(jī)制尚未明確［16］。

二、現(xiàn)行指導(dǎo)原則及法規(guī)要求

可見異物系指存在于注射劑、眼用液體制劑和無菌原料藥中，在規(guī)定條件下目視可以觀測到的不溶性物質(zhì)，其粒徑或長度通常大于50 μm［17］，而肉眼不可見的非代謝性的顆粒雜質(zhì)，粒徑通常小于50 μm［3］，被劃歸至不溶性微粒范疇。生物制品中的不溶性微粒可能是氣泡、硅油及蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生的多聚體甚至是沉淀［18］?？梢姰愇锖筒蝗苄晕⒘?2 項(xiàng)檢查對不溶性物質(zhì)的測量范圍相互銜接，根據(jù)藥品中不溶性物質(zhì)的危害程度，分別從宏觀和微觀進(jìn)行必要的控制，共同構(gòu)成一個完善的對不溶性物質(zhì)的質(zhì)控體系［3］。

通常對不溶性微粒/可見異物的檢查是按照《中華人民共和國藥典》2020 年版三部通則 0903 “不溶性微粒檢查法”及 0904“可見異物檢查法”對不溶性微粒和可見異物進(jìn)行，不溶性微粒檢查通常是在可見異物符合規(guī)定之后進(jìn)行［18］。

各國藥典對可見異物及不溶性微粒均有相應(yīng)要求，其標(biāo)準(zhǔn)基本與我國藥典要求一致。

對于可見異物，我國藥典中明確規(guī)定供試品中不得檢出明顯可見異物( 長度或最大粒徑超過2 mm) ，生物制品注射用無菌制劑復(fù)溶體積 50 mL及以下，每支( 瓶) 中細(xì)微可見異物不能超過3個，復(fù)溶體積 50 mL 以上，每支( 瓶) 中細(xì)微可見異物不能超過5個［17］。歐洲藥典〈2．9．20〉要求目視檢查法對可見異物進(jìn)行檢定，顆粒數(shù)量在每瓶5個可見顆粒，可見顆粒的測試結(jié)果將會報告為“幾乎無可見異物”［19］。

對于不溶性微粒，我國藥典要求若采用第一法(光阻法)，則標(biāo)示裝量為 100 mL 以下的靜脈用注射液、靜脈注射用無菌粉末、注射用濃溶液及供注射用無菌原料藥，除另有規(guī)定外，每個供試品容器(份)中含 10 μm 及 10 μm 以上的微粒數(shù)不得過6000 粒，含 25 μm 及 25 μm 以上的微粒數(shù)不得過600 粒。若采用第二法(顯微計數(shù)法)，則標(biāo)示裝量為 100 mL 以下的靜脈用注射液、靜脈注射用無菌粉末、注射用濃溶液及供注射用無菌原料藥，除另有規(guī)定外，每個供試品容器(份)中含 10 μm 及 10 μm 以上的微粒數(shù)不得過 3 000 粒，含 25 μm 及 25 μm 以上的微粒數(shù)不得過 300 粒。這一標(biāo)準(zhǔn)與歐洲藥典［19］是相同的。不同的是，歐洲藥典將該項(xiàng)目稱為 亞可見顆粒(sub-visible particle)，并規(guī)定亞可見微粒的粒徑為 10 ～ 25 μm; 我國藥典將該項(xiàng)目稱為不溶性微粒(particulate matter)［18］。歐洲藥典對于不溶性微粒的檢定方法及結(jié)果判定，與英國藥典與美國藥典基本一致。

此外，ICH Q4B《Test for Particulate Contamina- tion: Sub-Visible Particles General Chapter》［20］、ICH Q6B《Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products》［21］等國際指導(dǎo)原則均可作為可見異物、不溶性微粒研究分析及風(fēng)險評估的依據(jù)。

目前國內(nèi)外暫無專門針對由常用輔料與抗體蛋白作用引起的蛋白源性可見異物/不溶性微粒的相關(guān)指導(dǎo)原則或技術(shù)指南。

三、藥學(xué)評價的基本考慮

由于抗體藥物中抗原蛋白與表面活性劑作用的復(fù)雜性，隨著抗體藥物研究的深入，該類藥物放置過程中可見異物/不溶性微粒有增加的趨勢。藥物研發(fā)者應(yīng)對可見異物/ 不溶性微粒增加的原因進(jìn)行充分分析，明確可見異物/不溶性微粒的組成，進(jìn)而進(jìn)行充分的安全性評估，并確定風(fēng)險控制策略。以下筆者將結(jié)合審評實(shí)踐，就上述幾方面內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)闡述。

3． 1  深入分析可見異物/不溶性微粒增加的原因

藥物研發(fā)者應(yīng)基于對可見異物/不溶性微粒增加的根本原因的理解，在藥物開發(fā)早期發(fā)現(xiàn)并評估形成的風(fēng)險，如發(fā)生概率及嚴(yán)重程度等。若在藥物開發(fā)后期階段及產(chǎn)品上市后階段，發(fā)現(xiàn)可見異物/不溶性微粒增加，應(yīng)分析其形成原因及組成，如是否為單純的蛋白聚集或蛋白質(zhì)-PDMS 顆?；蚴侨芙庑圆畹腇FAs 顆粒等。除采用藥典方法對可見異物/ 不溶性微粒進(jìn)行檢定外，還可采用其他有效的蛋白、顆粒分析方法如傅立葉紅外光譜法( FT-IＲ) 、流式細(xì)胞儀 ( Flow Cam 法) 、HPLC 法及蒸發(fā)光散射檢測器法［5］等對可見異物/ 不溶性微粒結(jié)構(gòu)或組成進(jìn)行定性和定量分析，以明確其成分，所采用的非藥典方法應(yīng)經(jīng)過完善的方法學(xué)研究和驗(yàn)證。同時，結(jié)合分析方法研究和驗(yàn)證結(jié)果，明確如何區(qū)別工藝特征的顆粒物與新增顆粒物。

3．2 進(jìn)行充分的安全性評估

當(dāng)藥物放置過程中出現(xiàn)可見異物/不溶性微粒增加時，應(yīng)及時回顧所有歷史批次樣品可見異物數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況，包括長期、加 速和振蕩條件下微粒變化情況，以判斷整體變化趨 勢。通過對可見異物/不溶性微粒形成原因的深入分析，明確其是否對藥物本身質(zhì)量產(chǎn)生影響。此外，應(yīng)借鑒 ICH Q3D 指導(dǎo)原則［22］對元素雜質(zhì)的風(fēng)險評 估理念，對新增可見異物/ 不溶性微粒進(jìn)行全面毒理學(xué)評估，確定其每日最大暴露量(PDE)，如有臨床數(shù)據(jù)，應(yīng)結(jié)合既往臨床安全性數(shù)據(jù)評估新增可見異物/不溶性微粒的安全性。

3．3 風(fēng)險防控手段

藥物研發(fā)者應(yīng)遵循 ICH Q9指導(dǎo)原則在早期進(jìn)行風(fēng)險識別［4］，將可見異物/不溶性微粒列為制劑關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，建立可見異物/ 不溶性微粒風(fēng)險管理方法，以評估及控制其風(fēng)險。同時，在整個工藝和產(chǎn)品開發(fā)過程中，若識別到風(fēng)險信號，如發(fā)現(xiàn)了微粒、聚山梨酯顯著降解或微粒形成的高風(fēng)險信號，藥物研發(fā)者應(yīng)展開原因調(diào)查并采取風(fēng)險緩解或消除措施，以降低微粒形成的風(fēng)險因素。

藥物研發(fā)者在明確新增可見異物/不溶性微粒的形成與產(chǎn)品本身質(zhì)量發(fā)生變化無關(guān)后，可針對其特性采取風(fēng)險控制措施，如增加終端過濾、縮短有效期等。對于聚山梨酯引起的可見異物/不溶性微粒增加，亦可采用敲除宿主細(xì)胞脂肪酶基因、在純化工藝中使用適當(dāng)?shù)纳V樹脂以降低聚山梨酯的酶活性水平、采用聚山梨酯替代物或開發(fā)新的表面活性劑等; 對于P188 引起的可見異物/不溶性微粒增加，可根據(jù)分子特性對P188 進(jìn)行改進(jìn)，亦可在整個生產(chǎn)過程、包裝系統(tǒng)中減少含硅油組件的使用等。

綜上所述，隨著質(zhì)量源于設(shè)計(QbD) 理念的深入，藥物研發(fā)者在藥物的研發(fā)設(shè)計時，盡量避免出現(xiàn)由輔料引起的蛋白源性的可見異物/不溶性微粒風(fēng)險。若在臨床試驗(yàn)期間或產(chǎn)品上市后識別到顆粒物產(chǎn)生的風(fēng)險信號，應(yīng)首先明確可見異物/不溶性微粒增加的原因，判斷其結(jié)構(gòu)及組成; 其次可根據(jù)歷史數(shù)據(jù)回顧分析結(jié)果，結(jié)合毒理學(xué)甚至臨床安全性數(shù)據(jù)對新增可見異物/不溶性微粒對藥物的安全性影響進(jìn)行全面評估，基于安全性評估結(jié)果，結(jié)合分析方法研究及方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果，制定可見異物/不溶性微粒的可接受標(biāo)準(zhǔn)及明確依據(jù)，特別是在穩(wěn)定性考察中關(guān)注可見異物/不溶性微粒變化; 同時，制定有效的措施降低或消除風(fēng)險，最終消除可見異物/不溶性微粒的形成。