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摘要

 

作為藥物分析人員，堿性化合物是我們無(wú)法避免會(huì)遇到的一類化合物。對(duì)于弱極性堿性化合物（解離狀態(tài)下，該類化合物對(duì)應(yīng)的logD通常會(huì)大于0），其在酸性、中性及堿性流動(dòng)相體系中，均可在常規(guī)C18色譜柱上獲得良好的保留；對(duì)于中等極性化合物（在解離狀態(tài)下，該類化合物對(duì)應(yīng)的logD通常會(huì)在-1與0之間），其在小于自身pka的流動(dòng)性體系中，在常規(guī)C18色譜柱上通常呈現(xiàn)極弱保留或無(wú)保留特性，在極性官能團(tuán)嵌合的C18色譜柱（常見(jiàn)的有RP系列色譜柱、AQ系列色譜柱及T3色譜柱）上通常會(huì)得到有效保留；對(duì)于強(qiáng)極性堿性化合物（在解離狀態(tài)下，該類化合物對(duì)應(yīng)的logD通常會(huì)小于-1），其在小與自身pka的流動(dòng)性體系中，在常規(guī)C18色譜柱及極性官能團(tuán)嵌合的C18色譜柱上通常很難實(shí)現(xiàn)保留。

對(duì)于強(qiáng)極性堿性化合物無(wú)保留現(xiàn)象，常規(guī)增加保留的做法有：

1）配制高于化合物pka約1.5個(gè)單位的流動(dòng)相，以維持化合物分子態(tài)，繼而讓化合物在耐堿C18色譜柱上產(chǎn)生保留；

2）選擇強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（鍵合磺酸基團(tuán)），通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH以維持磺酸基團(tuán)及堿性化合物的離子態(tài)，通過(guò)庫(kù)倫作用力增加化合物保留。其保留機(jī)理如下：

 

 

3）選擇HILIC色譜柱通過(guò)強(qiáng)氫鍵作用力增加強(qiáng)堿性化合物的保留。

4）選擇常規(guī)C18色譜柱搭配長(zhǎng)鏈磺酸鹽離子對(duì)試劑使用，以增加強(qiáng)堿性化合物的保留。其作用機(jī)理如下：

 

 

5）選擇具有強(qiáng)陽(yáng)離子交換作用、疏水作用及氫鍵作用的混合作用力色譜柱（如comix系列），以增加強(qiáng)堿性化合物的保留。

除此之外是否還有其他的選擇呢？我們首先來(lái)看幾個(gè)案例。

 

案例1：阿替洛爾（Atenolol）

 

 

該化合物的關(guān)鍵理化信息如下：

 

 

圖1：阿替洛爾關(guān)鍵理化信息

 

由上，當(dāng)流動(dòng)相的pH≤5.5時(shí)，阿替洛爾的logD的預(yù)測(cè)值≤-2.82，常規(guī)流動(dòng)相體系中很難實(shí)現(xiàn)有效保留。為實(shí)現(xiàn)該化合物的有效保留，EP收錄的測(cè)定法采用了在流動(dòng)相中加入長(zhǎng)鏈烷烴磺酸鹽的辦法，具體色譜條件如下：

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（RP18-5 end-Capped or Waters Symmetry C18, 150mm*3.9mm*5μm）；以磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀3.4g，辛烷磺酸鈉1.0g，四丁基硫酸氫銨0.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-四氫呋喃-甲醇（900 : 20 : 180）為流動(dòng)相，等度洗脫。流速為每分鐘0.6ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm；進(jìn)樣體積為10μl。

對(duì)應(yīng)的典型加樣供試品譜圖如圖2所示：

 

 

圖2：長(zhǎng)鏈烷烴磺酸鹽體系下阿替洛爾加樣供試品譜圖

 

Hisham Hashem[1]等為實(shí)現(xiàn)該化合物的有效保留采用了在流動(dòng)相中加入高氯酸鈉的辦法，具體色譜條件如下：：

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Intersil® ODS-3, 150mm*4.6mm*5μm）；以50mM高氯酸鈉溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫。流速為每分鐘1.0ml；柱溫箱溫度為30ºC；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；進(jìn)樣體積為20μl。

 

線性洗脫梯度程序

 

時(shí)間（分鐘）	流動(dòng)相A（%）	流動(dòng)相B（%）
0	95	5
8	50	50
23	50	50

 

典型對(duì)照譜圖如圖3所示：

 

 

圖3：高氯酸鹽體系下阿替洛爾對(duì)照譜圖

 

高氯酸鹽體系下，阿替洛爾保留時(shí)間約為6min，對(duì)應(yīng)的保留因子k≈2，此時(shí)的洗脫陡度為5.6%B/min，對(duì)應(yīng)的有機(jī)相強(qiáng)度為34%，故此，緩梯度洗脫時(shí)，可以顯著增加阿替洛爾的保留。由此，高氯酸可以代替長(zhǎng)鏈烷烴磺酸鹽用于流動(dòng)相，來(lái)增加強(qiáng)極性堿性化合物的保留。

 

案例2：拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）

 

 

EP收錄的測(cè)定法色譜條件如下：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Hypersil BDS C18, 150mm*4.6mm*5μm）；以磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀2.7g，加水1000ml使溶解，取磷酸緩沖液900ml、三乙胺6ml，混勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫。流速為每分鐘1.0ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；進(jìn)樣體積為10μl。

 

線性洗脫梯度程序

 

時(shí)間（分鐘）	流動(dòng)相A（%）	流動(dòng)相B（%）
0	85	15
4	85	15
14	20	80

 

拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）分離圖如圖4所示：

 

 

圖4：EP收錄拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）分離圖

 

Jelena ?olovi? [2]等人在如下色譜條件下研究了拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）分離情況：

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Zorbax Extend C18, 150mm*4.6mm*5μm）；以140Mm高氯酸水溶液（用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5）-乙腈（77 : 33）為流動(dòng)相，等度洗脫。流速為每分鐘1.0ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；進(jìn)樣體積為5μl。拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）分離圖如圖5所示：

 

 

圖5：文獻(xiàn)[2]拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）分離圖

 

通過(guò)查詢沃特世的Selectivity Chart，可知Hypersil BDS C18的疏水指數(shù)為2.455、選擇性指數(shù)為0.291；Zorbax Extend C18的疏水指數(shù)為2.957、選擇性指數(shù)為0.331，故此可默認(rèn)兩款色譜柱等效。高氯酸體系下拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置異構(gòu)（Imp G）的分離優(yōu)勢(shì)可歸因與高氯酸根。

根據(jù)上述兩個(gè)典型的案例及相關(guān)文獻(xiàn)[3]可以明確高氯酸鈉作為離液劑的一種，可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)極性堿性化合物在酸性條件下的有效保留；可以提供結(jié)構(gòu)類似的強(qiáng)堿性化合物優(yōu)越的選擇性；且可以規(guī)避長(zhǎng)鏈烷烴類磺酸鹽對(duì)色譜柱不可逆的改性。類似的作用的陰離子還有PF6-、ClO4-、BF4 -、CF3COO –等[3]。至于其作用機(jī)理不在此處展開(kāi)敘述，感興趣的同仁可自行研讀相關(guān)文獻(xiàn)。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] Hisham Hashem, Ibrahim Adel Ehab. A novel stability indicating HPLC-method for simultaneous determination of atenolol and nifedipine in presence of atenolol pharmacopeoial impurities. J. Pharm. Sci., 2015, 5 (08): 017-025.

[2] Jelena Colovic, Milena Rmandic. Robust Optimization of Chaotropic Chromatography Assay for Lamotrigine and its Two Impurities in Tablets. Chromatographia, 2018.

[3] J. Flieger. The effect of chaotropic mobile phase additives on the separation of selected alkaloids in reversed-phase high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography A, 1113 (2006) 37–44