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在多肽固相合成中，為了能夠快速定性檢測氨基酸是否偶聯(lián)完全、Fmoc保護(hù)基團(tuán)是否脫除成功，我們通常使用一些顯色試劑對(duì)肽樹脂進(jìn)行檢測，其中茚三酮顯試劑由于具有顯色反應(yīng)迅速，顯色明顯，檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)成為最常用的顯色試劑。溴酚藍(lán)，四氯苯醌等也是比較常用的顯色試劑，今天我就向大家介紹一下各種顯色試劑的配制，使用方法以及注意事項(xiàng)。

 

1.  茚三酮顯色試劑

 

這種由Kaiser等人開發(fā)的檢測方法也叫做Kaiser檢測，可以清楚地顯示游離胺的存在。該測試通常在氨基酸偶聯(lián)過程之前和之后進(jìn)行，用此試劑顯色的方法，是目前應(yīng)用最廣泛的檢測試劑。

 

1.1   配制方法

 

試劑A: 80g苯酚溶于20ml乙醇，為方便配制，苯酚可以提前加熱融化后配制。

試劑B: 2ml的0.001M的KCN水溶液加入98ml重蒸后的吡啶中。KCN為劇毒管制品，如果不容易得到可以不加。重蒸吡啶過程中可以加入少量茚三酮以除去吡啶中能使茚三酮變色的物質(zhì)。

試劑C：5g茚三酮溶于95ml乙醇中。

 

1.2   檢測方法

 

取少量樹脂于杜氏玻璃小管中，一般樹脂的量以鋪滿試管底部一層為宜，之后加入上述配制好的A、B、C三種試劑各兩滴，于100-120℃下加熱3-5min。如果樹脂顯藍(lán)色說明存在未保護(hù)的氨基，脫Fmoc完成。如果樹脂無色說明偶聯(lián)反應(yīng)完全。

 

1.3   使用說明

 

雖然Kaiser測試是目前應(yīng)用最廣泛的檢測方法，但他也有自己的局限性，Kaiser測試不能檢測二級(jí)胺（如脯氨酸），也不能檢測無α-H的氨基酸的氨基（如二氨基異丁酸，α-甲基亮氨酸等α-雙取代氨基酸）。其機(jī)理如下圖a

 

 

茚三酮首先脫水與氨基縮合得到亞胺，因此只有氨或伯胺才能發(fā)生此步反應(yīng)，隨后亞胺脫羧后異構(gòu)化為另一種形式的亞胺，水解后釋放出出一分子伯胺和一分子醛。伯胺進(jìn)一步與茚三酮發(fā)生縮合得到二聚的亞胺衍生物從而顯色。對(duì)于二級(jí)胺，我們可以選擇后面將要提到的四氯苯醌來顯色。

 

2.  四氯苯醌顯色試劑

 

四氯苯醌顯色試劑也是一種比較常用的顯色試劑，主要用來檢測二級(jí)胺（如脯氨酸）。此外，脫Fmoc試劑一般都是二級(jí)胺（如哌啶，嗎啉，二甲胺），因此也可以用四氯苯醌顯色試劑來檢測肽樹脂從而判斷使用二級(jí)胺脫Fmoc后殘留的二級(jí)胺是否被洗滌干凈。

 

2.1   配制方法

 

試劑A: 2g四氯苯醌溶于98ml DMF中

試劑B: 2ml乙醛溶于98ml DMF中

 

2.2   檢測方法

 

取少量樹脂于杜氏玻璃小管中，一般樹脂的量以鋪滿試管底部一層為宜，之后加入上述配制好的A、B兩種試劑各兩滴，室溫下放置5-10min，如果樹脂顯藍(lán)綠色說明存在未保護(hù)的氨基。

 

3.  溴酚藍(lán)顯色試劑

 

顯色快速而敏感，但由于顯色過于敏感，偶聯(lián)結(jié)束后顯色常常顯示偽陽性。

 

3.1   配制方法

 

1g溴酚藍(lán)溶于99ml DMA中。

 

3.2   檢測方法

 

取少量樹脂于杜氏玻璃小管中，一般樹脂的量以鋪滿試管底部一層為宜，之后加入上述配制好的溴酚藍(lán)溶液，立即顯色。如果樹脂顯藍(lán)色說明存在未保護(hù)的氨基。

 

4.  TNBS顯色試劑

 

 

4.1   配制方法

 

試劑A: 5ml DIPEA溶于95ml DMF中

試劑B: 1g TNBS 溶于99ml水中

 

4.2   檢測方法

 

取少量樹脂于杜氏玻璃小管中，一般樹脂的量以鋪滿試管底部一層為宜，之后加入上述配制好的A、B兩種試劑各兩滴，室溫下放置10min，如果樹脂顯黃色或紅色說明存在未保護(hù)的氨基。

 

5.  小結(jié)

 

以上檢測試劑為多肽固相合成提供了快速的檢測方法，特別適合于多肽固相合成這種多步驟的連續(xù)反應(yīng)，但這種快速的檢測方法缺點(diǎn)也很明顯，它無法定量分析反應(yīng)進(jìn)程，只能定性檢測。特別是在脫Fmoc時(shí)，80% Fmoc被脫除與99% Fmoc被脫除用Kaiser測試都會(huì)顯示出陽性結(jié)果，如果Fmoc脫除步驟發(fā)生在困難序列，當(dāng)只有80%Fmoc被脫除而Kaiser檢測顯示陽性，則很有可能造成誤判為Fmoc脫除完全。此外，此種檢測方法標(biāo)準(zhǔn)很難制定，檢測時(shí)取樹脂的量很統(tǒng)一，在觀察檢測結(jié)果完全憑借主觀判斷，不同的人觀察同一份檢測結(jié)果可能有不同的描述，特別時(shí)在進(jìn)行困難偶聯(lián)后檢測很容出現(xiàn)樹脂淺藍(lán)色、樹脂微淺藍(lán)色透明，樹脂無色但溶液淺藍(lán)色，樹脂淺紫色等模糊不清的結(jié)果。對(duì)于這種情況，還是建議對(duì)肽樹脂進(jìn)行切割，然后用HPLC進(jìn)行分析。