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聚 (ε-己內(nèi)酯) (PCL) 作為性能良好的聚合物受到了廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)非炎性殼聚糖涂層促進(jìn)軟骨浸潤(rùn)到PCL支架內(nèi)及其上方，并且與骨小梁整合兼容。體外成骨試驗(yàn)預(yù)測(cè)骨整合到多孔支架中的能力有限，因?yàn)樵隗w內(nèi)，編織骨從再生骨小梁的前緣整合，而不是從粘附在支架表面的間充質(zhì)細(xì)胞整合，并且生物活性涂層吸引炎癥細(xì)胞而誘導(dǎo)骨吸收。

01、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

骨組織工程（BTE）策略旨在控制聚合物結(jié)構(gòu)和生物活性，以促進(jìn)骨生長(zhǎng)成多孔支架。盡管在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面取得了很大進(jìn)展，但在理解如何引導(dǎo)骨髓細(xì)胞和血管向內(nèi)遷移和分化，以在多孔支架深處形成礦化組織方面仍然存在挑戰(zhàn)。PCL作為首選的生物相容性聚合物受到了廣泛關(guān)注，部分原因是生物塑料可以熔化形成不同的形狀，支持間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 在體外的細(xì)胞浸潤(rùn)和成骨，并允許體內(nèi)編織骨沉積（在外源細(xì)胞或生物活性因子的幫助下）?？讖绞怯绊戵w內(nèi)骨整合到不同材料中的一個(gè)重要因素?？讖?le;100μm的支架顯示出有限的血管化，同時(shí)促進(jìn)軟骨形成。血管化的骨會(huì)自發(fā)地滲入具有>100μm-850μm 孔的支架中，但通常僅限于外孔。

此前的研究開發(fā)了具有完全互連孔和精確孔徑的 PCL 支架，以評(píng)估其潛力在 BTE 應(yīng)用中。PCL 具有抑制細(xì)胞附著的疏水表面，這是體外成骨所必需的。因此，制定了一種用親水性陽離子材料涂覆 PCL 支架孔表面的方法。這是通過聚電解質(zhì)（PDADMAC作為聚陽離子和PSS 作為聚陰離子）的逐層自組裝實(shí)現(xiàn)的。當(dāng) PCL 支架涂有 99% 脫乙酰度 (DDA) 殼聚糖時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 滲入 PCL 孔，在 3D體外成骨試驗(yàn)中產(chǎn)生更多礦化基質(zhì)?；谶@些有希望的結(jié)果，本研究的目的是使用已建立的骨骼成熟的兔骨軟骨修復(fù)模型，評(píng)估99% DDA 殼聚糖涂層對(duì) PCL 支架體內(nèi)成骨的影響。

在這項(xiàng)研究中，作者認(rèn)為血腫是植入后第一個(gè)占據(jù) BTE 支架的組織。最近的數(shù)據(jù)表明，結(jié)構(gòu)不同的殼聚糖具有不同的先天免疫激活潛力，可用于指導(dǎo)骨折修復(fù)反應(yīng)。99% DDA 殼聚糖微粒在體外可在人巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)，包括釋放干擾素 α 和白細(xì)胞介素 1 受體拮抗劑。因此，作者使用 99% DDA 10 kDa 殼聚糖來涂覆 PCL 支架，因?yàn)樗哂屑?xì)胞粘附性、非炎癥性和體內(nèi)潛在的抗炎活性。相比之下，約 80% DDA 殼聚糖微粒（但不大于 95%DDA）在摻入血腫時(shí)會(huì)特異性吸引中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并刺激血管生成。因此作者通過將 不同的PCL 支架壓入骨骺微鉆缺損中以驗(yàn)證以下假設(shè)：當(dāng)涂有 99% DDA 殼聚糖時(shí)，具有完全連通孔的 PCL 支架在體內(nèi)骨整合更多，而當(dāng)涂有 99% DDA殼聚糖+83% DDA殼聚糖微粒時(shí)，血管生成和成骨更多。僅鉆孔缺陷作為自發(fā)修復(fù)的對(duì)照并在手術(shù)后 6 周分析了每種情況下 6 個(gè)骨軟骨缺損的初始缺損和修復(fù)組織。

多孔 PCL 和殼聚糖涂層的制備：淬火后的45 vol% PCL/55 vol% PEO混合物分別退火1.5、2.0和2.5小時(shí)制造具有完全互連孔的 PCL 支架圓柱體，其中2 小時(shí)退火周期獲得的155μm±8μm 孔徑符合目標(biāo)（圖 1a 和 b）。直徑3毫米，厚2毫米的PCL 圓柱體用交替的聚電解質(zhì)逐層處理，然后用99%DDA殼聚糖與結(jié)構(gòu)匹配的殼聚糖熒光示蹤劑相結(jié)合(99PCL)。所有 99-PCL 支架表面均涂有 99% DDA 殼聚糖（約 1-3μm 厚的涂層，圖 1c）。將不含熒光示蹤劑 99-PCL 支架浸泡在含有 83% DDA RITC-殼聚糖示蹤劑（83-99-PCL）的稀釋 83% DDA 殼聚糖中，在 99PCL支架表面上獲得了均勻的 83% DDA 殼聚糖表面涂層（圖 1d）?？扇苄?83% DDA 殼聚糖留在 83-99-PCL 孔隙空間中，以生產(chǎn)殼聚糖微粒。

Fig. 1. Fabrication of porous PCL and chitosan coatings. (a) Scaffold blends of 45% PCL/55% PEO annealed for 1.5, 2 or 2.5 h yielded average pore sizes of 95 ± 4μm, 155 ± 8μm and 182 ± 10μm, respectively. (b) SEM image at 75× magnification of a PCL scaffold with average 155 μm pore diameter. Epifluorescent images of (c) 99-PCL (with RITC-99% DDA chitosan tracer) and (d) 8399-PCL (coated with unlabeled 99% DDA chitosan and then 83% DDA chitosan containing RITC83% DDA chitosan tracer).

“不對(duì)稱”凝塊趨化性測(cè)定：

分析先天免疫細(xì)胞 - 支架相互作用（圖2）。在 37°C 的 1 小時(shí)內(nèi)，外周血凝塊細(xì)胞“蜂擁”到 83-99-PCL 支架上，與 99PCL 和 PCL 相比，支架周邊的細(xì)胞密度高出2倍（p < 0.05，圖2a-c)，83-99-PCL凝塊收縮卻與另外3組凝塊收縮相似（圖2d）。如圖2e和2f所示，凝塊細(xì)胞可以吞噬部分99% DDA 殼聚糖涂層。至于 83% DDA 殼聚糖微粒，接近支架時(shí)越來越多地被吞噬細(xì)胞清除，最強(qiáng)烈的紅色熒光細(xì)胞占據(jù)孔隙并沿著 83-99-PCL 支架周邊聚集（圖2g），即在體外血腫中對(duì) 83-99-PCL有選擇性促炎趨化反應(yīng)。

Fig. 2. In vitro blood clot-scaffold interactions after 1 h of in vitro culture at 37?C. Rabbit blood clot/scaffold cryosections (a) unstained or (b) SafraninO/Fast greenstained, (c) clot cell density (n = 6) and (d) % clot retraction (n = 3). Epifluorescent images of clot samples showing RITC-chitosan (red) and Hoechst 33258-stained cell nuclei (grey scale), for (e) PCL/clot, (f) 99-PCL/clot and (g) 83-99-PCL/clot with chitosan microparticles (arrowheads, g1 inset), clot cells (arrows, open arrowheads), and cell clusters at the edge (g2, inset). Symbols: open triangles: clot cells inside the pores, white arrows: clot cells near the scaffold edge, white arrowheads: 83% DDA chitosan microparticles. Scale bars: (a,b) 1 mm, (c,d) 200μm, (e,f,g) 100μm.

宏觀表現(xiàn)：

在將支架植入出血滑車微鉆孔后，軟骨下血液以與缺陷出血強(qiáng)度（輕、中、重）平行的不同速率滲入 PCL 孔，與殼聚糖涂層無關(guān)（圖3）。在術(shù)后第 1 天，與支架相比，骨軟骨缺損術(shù)中出血、血腫形成和術(shù)后短暫的膝關(guān)節(jié)積液對(duì)6周修復(fù)組織的宏觀外觀影響較小(圖3a-d)。修復(fù) 6 周后，對(duì)照組被白色修復(fù)組織覆蓋，該組織也覆蓋了大部分 99-PCL 支架。許多單純PCL 和 83-99-PCL 植入物具有暴露的支架（空心箭頭，圖 3f-h）。83-99-PCL 修復(fù)組織呈紅色，提示血管生成（粗黑箭頭，圖 3h）。股骨遠(yuǎn)端外緣偶爾可見骨贅。所有膝關(guān)節(jié)滑液清澈，無積液跡象，外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)正常。愈合6周后，兔子活動(dòng)正常，膝蓋沒有感染跡象。

Fig. 3. Osteochondral defect intra-operative bleeding, hematoma formation and transient post-operative knee effusion had minor effects compared to scaffold on macroscopic appearance of 6 week repair tissues. Panels show variable bleeding in drill holes (a-b) before and after implanting the scaffolds, (c) hematoma formation at day 1, and (d) cumulative post-operative knee effusion scores and representative macroscopic appearance of repair tissues for (e) 83-99-PCL, (d) 99-PCL, (g) PCL, (h) drill-only. Symbols (e-h) Thick black arrow: angiogenic tissue; open arrows: exposed PCL bioplastic, thin arrows: cartilage repair tissue.

組織學(xué)及影像學(xué)表現(xiàn)：

植入體內(nèi)一天后，PCL支架孔表面檢測(cè)到殼聚糖涂層，而83%DDA殼聚糖微粒被置換到孔中支架凝塊的頂部，這表明來自關(guān)節(jié)腔方向的軟骨下出血的壓力將顆粒向上推到骨板區(qū)域（圖4紅色信號(hào)）。在 83-99PCL、99-PCL和PCL 支架下方鉆孔的彎曲底部形成血腫（圖4c，f，圖5）。在該區(qū)域，細(xì)胞在 83-99-PCL下方被耗盡，只在支架邊緣發(fā)現(xiàn)（圖4c黑色箭頭）。骨折血腫細(xì)胞更均勻地分布在 99-PCL、PCL和單純鉆孔缺陷的下方（圖4f）。在83-99-PCL 和99-PCL 支架內(nèi)和周圍觀察到含有熒光RITC-殼聚糖的吞噬細(xì)胞（圖4a，d白色箭頭）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這樣的假設(shè)，即83-99-PCL 支架對(duì)血腫吞噬細(xì)胞具有趨化性，并且吞噬細(xì)胞可以攝取兩種殼聚糖涂層。

Fig. 4. Hematoma phagocytes swarmed to (a-c) 83-99-PCL and not (d-f) 99-PCL scaffolds after 1 day in vivo. The red signal shows (a) 83% DDA or (d) 99% DDA chitosan and (b, e) matching nonspecific green epifluorescence of the hematoma of the same field. Panels (c & f) show Toluidine blue/ von Kossa stained hematoma below the scaffolds (PCL polymer is indicated by (*) where hematoma cells (blue stain) were displaced towards (c) 83-99PCL and not (f) 99-PCL. Symbols: (a,b,d,e) open arrows: chitosan coating; * = PCL polymer; open arrowheads: detached chitosan coating; thin white arrows: phagocytes with internalized RITCchitosan; (c,f) black arrows: hematoma cells. Scale bars: 250μm.

術(shù)后6周，純鉆頭缺損顯示出持續(xù)的經(jīng)典自發(fā)性軟骨內(nèi)修復(fù)反應(yīng)，其中鈣化軟骨的核心正經(jīng)歷著來自周圍骨小梁的強(qiáng)烈的血管性骨入侵（圖5，6a-b）。當(dāng)分析平均橫截面積時(shí)，單純?nèi)睋p在缺損邊緣和中部附近時(shí)軟骨下鈣化軟骨較多（圖7a）。發(fā)現(xiàn)主要是軟骨組織從骨板的孔隙中浸潤(rùn)出來，并不同程度地覆蓋在PCL和99-PCL支架上（圖5和6）。這些修復(fù)組織的形態(tài)表明，軟骨是由緊鄰骨小孔的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)形成的。與PCL相比，軟骨下軟骨平均滲入99-PCL孔隙更遠(yuǎn)（圖5和6c-d & 7a）。83-99PCL支架孔隙以及支架中間明顯沒有軟骨，邊緣有0.2 mm2的軟骨下軟骨（圖5和6f-g & 7a）。

觀察到83-99-PCL有強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)，血管圍繞著整個(gè)支架的孔隙并完全浸潤(rùn)其中（圖5o、5和6g紅色組織）。單純?nèi)睋p和83-99-PCL缺損的血管長(zhǎng)度密度（Lv）相似（圖7b），然而單純?nèi)睋p的血管被礦化組織包裹（圖6b），而83-99-PCL的血管則被非礦化纖維組織或未分化的間質(zhì)包裹（圖6g1，g2）。與PCL或99-PCL相比，單純?nèi)睋p修復(fù)組織和83-99-PCL孔隙組織所含的血管Lv明顯升高（圖7b）。綜上所述，親炎癥的83%DDA殼聚糖刺激了整個(gè)PCL支架孔的血管生成，并抑制了軟骨生成和成骨。

SafraninO（SafO）染色的軟骨修復(fù)組織重現(xiàn)缺陷與作為解釋變量的軟骨下面積呈正相關(guān)（R2=0.44，P<0.0001）。在這項(xiàng)研究中，單純?nèi)睋p在修復(fù)6周后顯示出良好的SafO染色的軟骨再生（圖5、6a和7c）。覆蓋支架的軟骨修復(fù)組織較少，83-99-PCL上的軟骨最少，PCL中間的軟骨較少（圖7c）。99%DDA殼聚糖的主要影響是，在支架中間上方的SafO+軟骨復(fù)位與單獨(dú)的PCL相比，保持3倍以上的SafO+軟骨復(fù)位（圖7c）。這種效果部分是由于純PCL支架中間的軟組織重鋪不理想（圖7d）。

根據(jù)對(duì)鉆孔中礦化組織再生的顯微CT測(cè)量（圖8），初始缺損的骨量分?jǐn)?shù)在單純?nèi)睋p修復(fù)6周后顯著增加，用PCL或99-PCL的缺損略高，而83-99-PCL則較低（圖8f）。最初的缺損鉆孔橫截面積為7.5 mm2，在單純?nèi)睋p中，頂部縮小到3.5 mm2，在0.5 mm深的骨小梁處縮小到1 mm2（圖8g）。在6周修復(fù)的PCL和99-PCL缺損中，殘留的鉆孔面積略微縮小至6.5 mm2，與第1天的缺損沒有明顯區(qū)別。相比之下，83-99-PCL缺損的鉆孔橫截面積凈增1毫米（圖8g）。在6個(gè)支架中的4個(gè)中，編織的骨質(zhì)滲入99-PCL和PCL孔隙深處0.3-1毫米。在所有的支架孔隙表面（99-PCL、PCL和83-99-PCL）都檢測(cè)到骨髓來源的細(xì)胞附著。因此，殼聚糖涂層對(duì)于細(xì)胞在體內(nèi)粘附到疏水性PCL孔隙表面是不必要的。

Fig. 5. Nondecalcified histology at the defect edge or middle showing a hematoma filling PCL pores at Day 1 and bone marrowderived repair tissues filling the pores at 6 weeks post-operative. Panels show (a-d) Drill-only, (e-h) PCL, (i-l) 99-PCL, (m-p) 8399-PCL non-decalcified plastic sections, stained with SafO-fast green (Edge: a1,c1, e1,g1,i1,k1,m1), von Kossa/Toluidine blue (edge and middle: b,d,f,h,j,l,n,p) or Goldner Trichrome (Edge: o1; Middle: a2,c2,e2, g2,i2,k2,m2,o2). SafO stains cartilage tissue red, Goldner Trichrome stains bone green and newly deposited bone, blood vessels and cartilage pink/red, von Kossa/Toluidine blue stains mineralized cartilage and bone black, cartilage tissue purple. Scale bar: 1 mm.

Fig. 6. High-magnification histology of representative 6 week subchondral repair tissues stained with Toluidine blue-von Kossa (a,c,d,e,g2) or Goldner trichrome (b, f,g1). Drill-only defects (a-b) were undergoing endochondral ossification where bone and blood vessels invade calcifying cartilage. Scaffold pore tissues, here shown for 99-PCL, included (c) cartilage, (d) calcifying cartilage (CC), and (e-f) vascular new woven bone (NWB) or unmineralized angiogenic tissue. Angiogenic blood vessels in 83–99-PCL were often enveloped in fibrous tissue (F, in panels g1-g2). Symbols: Arrows: blood vessels. CC: calcified cartilage; NWB: new woven bone. F: fibrous tissue. Scale bars: (a,f,g1,g2) 250μm, (b,c,d,e) 50μm.

Fig. 7. Histomorphometry of subchondral (a1-a2) cartilage infiltration, (b1-b2) blood vessel stereology of angiogenesis (vessels/mm2), and % defect resurfacing with (c1-c2) Safranin O+ cartilage or (d1-d2) all soft repair tissue from transverse sections near the defect edge (a1-d1) and middle (a2-d2). Graphs show individual data points (dots), median (horizontal line), interquartile range (box) and min-max (whiskers), N = 6.

Fig. 8. Example micro-CT images of mineralized tissue formation in microdrill defects at day 1 (a) and 6 weeks (b-e, conditions as indicated), (f) measures of bone volume fraction (%) in a 3 mm diameter 2 mm deep volume of interest, and (g) residual drill hole area (mm2) at the drill hole top and−0.5 mm below the chondralosseous junction (labeled as 0, -0.5 mm, panel g). Graphs show individual data points (dots), median (horizontal line), interquartile range (box) and min-max (whiskers), N = 6. Scale bar: 1 mm.

本研究受到少量生物復(fù)制、鉆孔中植入物位置相對(duì)于軟骨-骨連接處的微小差異以及6周終點(diǎn)持續(xù)修復(fù)的限制。關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)支架表面重修具有可變且不受控制的影響，并且在解剖學(xué)上彎曲成滑車槽形狀的支架形狀可能改善了支架上的軟骨修復(fù)（圖9）。

Fig. 9. Diminished resurfacing over some proximal defects was potentially due the curvature of the trochlea and thinner cartilage that led to greater shear forces in the middle of the scaffold, as illustrated through (a) 3-D micro-CT of a rabbit distal femur and sagittal histology sections collected in this study, (b1-b2) macroscopic images of repaired drill holes, (c) serial sagittal sections, and (d1-d2) transverse view of the trochlear groove. Trochlear cartilage is thinner in the proximal area than the distal area, suggesting that shear forces on the flat scaffold that occasionally reached above the tidemark may have been greater in the proximal sites and rubbed off some early mesenchymal tissues growing out and over the pores. A concave scaffold design (d2) would better accommodate shear forces. L0: outside the defect area. L1: edge sagittal section. L2: middle sagittal section.

綜上所述，孔徑為155μm的 PCL 支架可引發(fā)自發(fā)的無血管間充質(zhì)和軟骨生成，或在支架深度達(dá)1mm的血管生成間充質(zhì)和成骨。99%DDA殼聚糖涂層促進(jìn)了軟骨下軟骨形成和透明樣軟骨的表面重建。作者還發(fā)現(xiàn)軟骨是由骨板在植入物上再生（骨源性軟骨誘導(dǎo)）形成的，軟骨組織可以從通過毛孔和關(guān)節(jié)支架表面遷移的骨髓組織進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)中觀察到血管編織骨和鈣化軟骨組織浸潤(rùn)支架孔，是對(duì)先前測(cè)試的用于軟骨修復(fù)的無細(xì)胞BTE支架的改進(jìn)。