中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

摘要：【目的】建立 44 種常用兒童藥品的微生物限度檢查方法?！痉椒ā堪础吨袊幍洹?015 及 2020 年版四部通則，分別采用常規(guī)法、中和法或稀釋法等對 44 種常用兒童藥品的微生物限度檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。【結(jié)果】需氧菌總數(shù)計數(shù)：化學(xué)口服液體制劑可采用 1:10 平皿法檢查；中藥制劑需對樣品進(jìn)行中和處理，其中，中藥口服液體制劑可采用 1:10 平皿法檢查，中藥顆粒劑可采用 1:100 平皿法檢查。所有樣品的霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)均可采用 1:10 平皿法檢查。所建立的檢查方法對 5 種試驗(yàn)菌株的回收比值均在 0.5~2.0之間，試驗(yàn)組控制菌均可檢出，陰性對照組均未檢出，符合《中國藥典》要求?！窘Y(jié)論】建立的方法準(zhǔn)確可靠，可用于 44 種常用兒童藥品的微生物限度檢查及質(zhì)量控制。

 

兒童藥品[1]因用藥人群的特殊性，其安全性成為社會關(guān)注的重點(diǎn)問題。藥品微生物檢驗(yàn)作為保障藥品安全的重要措施[2]之一，其結(jié)果經(jīng)常會受到藥物劑型、處方和檢驗(yàn)技術(shù)等多種因素的影響。因此，為了獲得準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《中國藥典（2020 年版）》[3]的規(guī)定，應(yīng)根據(jù)藥品的理化特性等進(jìn)行微生物方法適用性試驗(yàn)[4-6]，并建立適宜的微生物檢驗(yàn)方法。

國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的兒童藥品以顆粒劑、片劑和液體口服制劑為主[7-8]。其中，顆粒劑多為中藥制劑，大多具有清熱解毒的作用；口服液體制劑通常含有防腐劑，對微生物的生長存在一定的影響，因而無法采用直接接種的方法進(jìn)行微生物檢驗(yàn)。因此，如何快速、準(zhǔn)確地建立適宜的微生物檢驗(yàn)方法也成為了兒童藥品生產(chǎn)單位和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)面臨的一大難題。

目前尚未有針對兒童藥品的微生物限度檢查方法的系統(tǒng)研究報道。鑒于此，本研究選擇顆粒劑和口服液體制劑為主要代表，建立了 44 種常用兒童藥品的微生物限度檢查方法，并對結(jié)果進(jìn)行分析討論，為兒童藥品的生產(chǎn)單位和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)建立有效可行的微生物限度質(zhì)量分析方法提供參考，以達(dá)到減少方法建立工作量、提高檢測效率以及為兒童藥品的優(yōu)先審評[9]提供數(shù)據(jù)支持的目的。

 

1、材料與方法

 

1.1 材料

 

1.1.1 主要儀器 BSA2202S 型電子天平（德國 Sartorius 公司），MSC1.8 型生物安全柜（美國 Thermo 公司），恒溫培養(yǎng)箱（日本 Sanyo 公司）等。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）[CMCC(B)26003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）[CMCC(B)10104]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）[CMCC(B)63501]，大腸埃希菌（Escherichia coli，EC）[CMCC(B)44102]，乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B，SP）[CMCC(B)50094]，白色念珠菌（Candida albican，CA）[CMCC(F)98001]，黑曲霉（Aspergillus niger，AN）[CMCC(F)98003]。均購于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（CMCC），使用前均進(jìn)行了鑒定確認(rèn)。

1.1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VRBG）（德國默克 Merck 公司）；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE）（青島海博生物技術(shù)有限公司）；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（RVS）（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MACA）、麥康凱液體培養(yǎng)基（MAC）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（CA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（MSA）、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH7.0）等（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.1.4 供試品 氨溴特羅口服溶液（1）、布洛芬混懸液（2）、多潘立酮混懸液（3）、核酪口服溶液（4）、美敏偽麻溶液（5）、鹽酸氨溴索口服溶液（6）、 鹽酸丙卡特羅口服溶液（7）、右旋糖酐鐵口服溶液（8）、對乙酰氨基酚口服溶液（9）、復(fù)方氨酚美沙糖漿（10）、開喉劍噴霧劑(兒童型)（11）、維生素 D滴劑（膠囊型）（12）、維生素 AD 滴劑(膠囊型)（13）、肺力咳合劑（14）、小兒肺熱咳喘口服液（15）、健兒清解液（16）、小兒消積止咳口服液（17）、金振口服液（18）、小兒柴桂退熱口服液（19）、小兒清熱利肺口服液（20）、雙黃連口服液（21）、百咳靜糖漿（22）、小兒感冒寧合劑（23）、小兒豉翹清熱顆粒（24）、小兒退熱顆粒（25）、醒脾養(yǎng)兒顆粒（26）、小兒腸胃康顆粒（27）、小兒清肺化痰顆粒（28）、小兒清熱止咳顆粒（29）、猴耳環(huán)消炎顆粒（30）、雙黃連顆粒（31）、小兒柴桂退熱顆粒（32）、小兒清咽顆粒（33）、小兒咽扁顆粒（34）、健脾生血顆粒（35）、小兒肺咳顆粒（36）、小兒肺熱咳喘顆粒（37）、小兒金翹顆粒（38）、小兒宣肺止咳顆粒（39）、兒童回春顆粒（40）、清宣止咳顆粒（41）、多動寧膠囊（42）、腎衰寧膠囊（43）、小兒布洛芬栓（44），共 44 種樣品，由上海市各轄區(qū)市場監(jiān)督管理局抽樣送檢。

 

1.2 方法

 

1.2.1 菌液的制備 參照《中國藥典（2020 年版）》四部通則 1105 及 1106。

1.2.2 供試液的制備 制備方法 A：取供試品 10 g 或 10 mL，加 pH7.0 至 100 mL，均質(zhì)混勻，作為 1:10 的供試液。

制備方法 B：取供試品 10 g 或 10 mL，加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（含 3%聚山梨酯-80 及 0.3%卵磷脂）（pH7.0+）至 100 mL，均質(zhì)混勻，作為 1:10 的供試液。

制備方法 C：取供試品 10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（含 3%聚山梨酯-80 及 0.3%卵磷脂）（TSB+）至 100 mL，均質(zhì)混勻，作為 1:10 的供試液。

制備方法 D：取小兒布洛芬栓 10 g，加入 20 mL 不超過 40 ℃的無菌十四烷酸異丙酯，均質(zhì)混勻，再加70 mL 不超過 40 ℃的 pH7.0+，均質(zhì)混勻，作為 1:10 的供試液。

必要時，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步稀釋制成 1:100 的供試液。

1.2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗(yàn) 取 1:10 或 1:100 的供試液各 10 mL，分別加入試驗(yàn)菌液 0.1 mL，混勻，使每 1 mL 供試液中含菌量<100 cfu。取其 1 mL，加入 15~20 mL 的溫度不超過45 ℃熔化的瓊脂培養(yǎng)基（含或不含 3%聚山梨酯 80 及 0.3%卵磷脂），混勻，凝固，培養(yǎng)。

1.2.4 控制菌檢查 ① 大腸埃希菌：取 1:10 的供試液 10 mL 接種至 100 mL 的 TSB 中，33 ℃培養(yǎng) 18 h，

取上述培養(yǎng)物 1 mL 接種至 100 mL 的 MAC 中，42 ℃培養(yǎng) 24 h 后劃線接種于 MACA，33 ℃培養(yǎng) 18 h。② 耐

膽鹽革蘭陰性菌：分別取按照制備方法 C 的供試液 10 mL 置 23 ℃培養(yǎng) 2 h。依次取相當(dāng)于 0.1、0.01 和 0.001g 供試品的預(yù)培養(yǎng)物接種至 10 mL 的 EE 中，33 ℃培養(yǎng) 24 h 后，劃線接種于 VRBG，33 ℃培養(yǎng) 18 h。③ 沙門菌：取供試品 10 g 或 10 mL 接種至 200 mL 的 TSB（含或不含 1%聚山梨酯 80）中，均質(zhì)混勻，33 ℃培養(yǎng) 18 h。取上述培養(yǎng)物 0.1 mL 接種至 10 mL 的 RVS 中，33 ℃培養(yǎng) 18 h 后劃線接種于 XLD，33 ℃培養(yǎng) 18 h。④ 金黃色葡萄球菌：取 l:10 供試液 10 mL 接種至 100 mL 的 TSB+中，33 ℃培養(yǎng) 18 h，取上述培養(yǎng)物劃線接種于 MSA，33 ℃培養(yǎng) 18 h。⑤銅綠假單胞菌：取 l:10 供試液 10 mL 接種至 100 mL 的 TSB+中，33 ℃培養(yǎng) 18 h 后劃線接種于 CA，33 ℃培養(yǎng) 18 h。

分別參照上述方法，同時加入<100 cfu 的陽性菌同步培養(yǎng)，形成陽性對照。

1.2.5 計算及結(jié)果判斷 需氧菌總數(shù)和霉菌和酵母菌總數(shù)回收比值按如下公式計算：

各菌株回收比值=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)−供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液對照組的平均菌落數(shù)。

各菌株回收比值應(yīng)在0.5~2.0范圍內(nèi)，控制菌檢查適用性試驗(yàn)的陽性對照均能正常生長。

 

2、結(jié)果

 

2.1 樣品來源分布

44種樣品來自于全國不同生產(chǎn)企業(yè)，其中化學(xué)藥品13件，占29.95%；中成藥31件，占70.45%；液體23件，占52.27%；固體21件，占47.73%。除1件為直腸給藥制劑，1件為口腔黏膜給藥制劑外，其余均為口服給藥制劑。具體分類見圖1。

圖片

2.2 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗(yàn)

由于中藥制劑存在一定的抑菌性，需首先對樣品供試液進(jìn)行中和處理。8類樣品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法詳見表1，各樣品的試驗(yàn)回收比值見表2。

 

 

 

 

 

 

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

 

大腸埃希菌均可接種至100 mL的TSB中檢查；一般樣品的沙門菌均可接種至200 mL的TSB中檢查，滴劑為油性液體，沙門菌在200 mL的TSB中加入1%的聚山梨酯80檢查；耐膽鹽革蘭氏陰性菌均可接種至10 mL的EE中檢查；開喉劍噴霧劑（兒童型）可直接接種至100 mL的TSB中檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，但小兒布洛芬栓則需接種至100 mL的TSB+中。見表3。

 

 

 

3、 討論

 

本文按照《中國藥典（2020 年版）》四部通則的要求，建立了 44 種常用兒童制劑的微生物限度檢查方法。中藥制劑多含有清熱解毒的成分，有一定的抑菌性，對微生物計數(shù)方法的影響較大。以顆粒劑為例，其中小兒豉翹清熱顆粒的處方中含有薄荷、青蒿、黃芩和大黃等成分。有研究顯示，薄荷提取物，尤其是薄荷精油、青蒿對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制效果[10-12]。而黃芩和大黃也被多次報道對常見的致病菌具有很強(qiáng)的抑制作用[13-16]。本研究也證實(shí)小兒豉翹清熱顆粒在檢查需氧菌總數(shù)時需聯(lián)合采用中和法和稀釋法。單采用 1:10 的供試液進(jìn)行回收試驗(yàn)時，PA 的回收率為 0.22，SA 和 BS 的回收率均為 0；改用稀釋法，即采用 1:100 的供試液進(jìn)行回收試驗(yàn)時，3 種微生物的回收率均>0.5。小兒退熱顆粒和醒脾養(yǎng)兒顆粒單純采用 1:10 的供試液結(jié)合中和法進(jìn)行需氧菌總數(shù)檢查時，細(xì)菌的回收率均<0.5，經(jīng)進(jìn)一步的稀釋至 1:100 的供試液后均>0.5。值得注意的是，即使是同一品種，但是不同生產(chǎn)廠家的樣品，需氧菌總數(shù)的回收率也存在一定的差異。廠家 A 的小兒瀉速停顆?？刹捎弥泻头ㄟM(jìn)行需氧菌總數(shù)檢查，廠家 B 則需采用中和稀釋法。因此，對剩余的中成藥的固體制劑均采用 1:100 的供試液進(jìn)行需氧菌總數(shù)的檢查。

 

口服液體制劑（如口服溶液劑、口服混懸液和合劑等）水活度高，容易變質(zhì)，不易保存，一般含防腐劑，用供試品原液做需氧菌總數(shù)的回收時，回收比值通常達(dá)不到 0.5[17]，將原液稀釋 10 倍，可消除其抑菌性?；瘜W(xué)口服液體制劑可采用直接接種法；中成藥類的口服液體制劑有一定的抑菌性，需聯(lián)用培養(yǎng)基中和法。以肺力咳合劑和小兒肺熱咳喘口服液為例，采用直接接種法進(jìn)行檢查，枯草芽孢桿菌的回收率均<0.5，進(jìn)一步采用中和法，即選擇 pH7.0+進(jìn)行樣品制備，結(jié)果均符合規(guī)定。對剩余的 8 種中成藥類的口服液體制劑采用中和法進(jìn)行微生物限度方法適用性檢查，需氧菌總數(shù)計數(shù)回收率結(jié)果均在 0.5~2.0 之間。

 

由于布洛芬[18]的不同制劑類型間輔料成分不同，抑菌性也存在差異。布洛芬混懸液、顆粒、片劑、膠囊劑型抑菌性不大，可用平皿及稀釋法進(jìn)行檢驗(yàn)，而軟膠囊和緩釋片抑菌性較強(qiáng)，需采用薄膜過濾法進(jìn)行檢驗(yàn)[19]。本研究中的布洛芬混懸液用平皿法即可，而小兒布洛芬栓采用中和法進(jìn)行計數(shù)回收時，枯草芽孢桿菌的回收率為 0.31，將瓊脂培養(yǎng)基從 15~20 mL 增加至 100 mL 時，需氧菌總數(shù)回收率均>0.5。

 

本研究的 44 種制劑的霉菌和酵母菌總數(shù)均可以采用平皿法檢測，由此可見，中成藥通常對細(xì)菌，特別是對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定抑菌作用，而對白色念珠菌和黑曲霉基本無抑菌作用。因此，在日常檢驗(yàn)中，對中成藥類藥品可先采用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為敏感菌株進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以減少工作量，提高工作效率。

 

通常，藥品的微生物檢驗(yàn)是一種“個性化”的檢驗(yàn)，每種藥品需根據(jù)其特性，通過方法適用性試驗(yàn)建立符合要求的供試品檢查方法。一般的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，對于微生物檢驗(yàn)通常較為簡略，未具體描述其檢驗(yàn)方法，僅要求符合制劑項下的規(guī)定。除此以外，藥品微生物檢驗(yàn)項目與其處方密切相關(guān)。在本院長期的標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核、檢驗(yàn)及文獻(xiàn)報道中，許多微生物技術(shù)人員對于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方、制法等理解存在偏差，甚至不清楚該檢查哪些控制菌，誤檢、漏檢微生物項目的現(xiàn)象時有發(fā)生[20]。尤其是部分中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未明確處方或制法，給微生物檢驗(yàn)帶來一定的難度，建議在中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)明確制法。同時，藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，宜明確微生物限度檢查的具體方法。

 

兒童藥品不是簡單的成人藥品的成分減量，其開發(fā)研究需要投入大量的時間和精力。我國目前兒童用藥較為缺乏，政府對兒童藥物的上市提供快速優(yōu)先審評的綠色通道。本研究擬通過系統(tǒng)研究，建立一個適用于兒童藥品的通用微生物限度檢查方法，以減少工作重復(fù)，加速檢驗(yàn)，保障兒童用藥的安全有效。