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1903年Tswett應(yīng)用吸附原理有效分離了植物色素，自此拉開了現(xiàn)代液相色譜學(xué)的序幕。隨著色譜學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，液相色譜法至今已廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域、制藥領(lǐng)域、環(huán)境領(lǐng)域、生物療法及生物群落研究領(lǐng)域。而液相色譜法的核心在于色譜柱，色譜柱的核心又在于色譜柱填料。故此，若要成為一名優(yōu)秀的色譜分析者，有必要去了解硅膠顆粒的設(shè)計及硅膠顆粒表面化學(xué)修飾，并根據(jù)目標(biāo)組分快速準(zhǔn)確的選擇合適填料的色譜柱至關(guān)重要。

目前市售的反相色譜柱大多以直徑在1.7μm~10μm硅膠顆粒作為固定相載體。其內(nèi)在原因可能是：1）硅膠化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不會與強堿和氫氟酸以外的物質(zhì)反應(yīng)，安全的pH使用范圍一般在2~8，該范圍一般能夠滿足大部分化合物的分析需求；2）裸硅膠（如圖1A所示）以硅氧四面體(SiO?)??作為一個基本結(jié)構(gòu)單元，無數(shù)個結(jié)構(gòu)單元的橋聯(lián)構(gòu)成了宏觀上的硅膠；眾多未進行橋聯(lián)的單元終端則形成硅膠顆粒的表面或內(nèi)表面（如圖1B所示）；而這些裸露的表面上存在大量可供功能團鍵合的-Si-OH位點（如圖1C所示）。

 

 

圖1 （A）硅膠顆粒SEM圖；（B）孔隙局部放大SEM圖；（C）孔隙表面分子排布示意圖

 

接著-Si-OH鍵合位點往下聊。目前市場上主流的色譜柱技術(shù)資料上經(jīng)常會看到這樣的字眼：單官能團鍵合、雙官能團鍵合以及三官能團鍵合。其鍵合方式可用如圖2所示的原理圖進行描述，即一當(dāng)量-Si-OH與一當(dāng)量的單氯代硅烷試劑發(fā)生單官能團鍵合；二當(dāng)量-Si-OH與一當(dāng)量的雙氯代硅烷試劑發(fā)生雙官能團鍵合；三當(dāng)量-Si-OH與一當(dāng)量的三氯代硅烷試劑發(fā)生三官能團鍵合。由單官能團鍵合至三官能團鍵合，其對酸的耐受程度是逐漸增加的，也就是說三官能團鍵合填料可以再更低pH的流動相中使用。此外需指出，等摩爾當(dāng)量的硅醇基，由于鍵合方式的不同會存在碳載量方面的差異。理論上同一品牌同一類別的色譜柱，單官能團鍵合至三官能團鍵合其碳載量會呈現(xiàn)較小趨勢，這也就是說載樣量會呈現(xiàn)減少趨勢。

 

 

圖2 裸露硅醇基與氯代硅烷試劑鍵合原理圖及耐酸程度示意圖

 

 

圖3 空間位阻效應(yīng)示意圖

 

為了提高色譜柱對酸堿及溫度的耐受范圍，需要減小酸堿侵蝕-Si-O-Si-的可能及幾率，換言之，即需要減小硅膠基底溶解及鍵合相流失的可能和幾率。如何去實現(xiàn)這一目標(biāo)呢？其一，通過空間位阻效應(yīng)來實現(xiàn)。其核心思想就是在硅烷烴側(cè)鏈鍵合具有較大位阻效應(yīng)的烷烴基團，如異丙基、異丁基等。示意圖如圖3所示。隨著側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F的位阻效應(yīng)的增加，其對水合氫離子及氫氧根離子的屏蔽作用越強，侵蝕性離子愈難通過“屏蔽層”使-Si-O-Si-鏈斷裂。從而保證在更寬的流動相pH范圍硅膠不水解及鍵合相不流失。

其二，通過雙齒鍵合實現(xiàn)。其核心思想就是先將兩分子氯代硅烷試劑通過丙基鏈接，然后鍵合到硅膠表面。其示意圖如圖4所示。該技術(shù)亦可有效避免侵蝕性離子通過“屏蔽層”，繼而使-Si-O-Si-鏈斷裂

 

 

圖4 雙齒鍵合示意圖

 

其三，通過亞乙基橋聯(lián)雜化實現(xiàn)。其核心思想就是將氯代硅烷試劑通過亞乙基鏈接至硅膠表面。其示意圖如圖5所示。該技術(shù)亦可有效降低侵蝕性離子使鍵合相水解的風(fēng)險。

 

 

圖5 亞乙基橋聯(lián)雜化示意圖

 

其四，通過封端實現(xiàn)。其核心思想就是通過封端試劑（三甲基氯硅烷、六甲基乙硅氧烷、三甲基硅咪唑等）與殘存的硅醇基反應(yīng)，使水合氫離子及氫氧根離子難以水解硅膠基底。其示意圖如圖6所示。

 

 

圖6 TMS封端示意圖

 

至于上述增加色譜柱對酸堿耐受度的手段對標(biāo)市售哪一款色譜柱不在本文討論范圍，有興趣的可自行查閱資料。聊完減小硅膠基底溶解及鍵合相流失的方式方法后，我們來聊一聊常見的鍵合相。如圖7所示，常用的色譜柱有C18（內(nèi)嵌極性官能團的色譜柱如RP系列、AQ系列、T3系列等色譜柱未在表中體現(xiàn)）、已基苯基柱（五氟苯基柱未在表中體現(xiàn)）、丙基氰基柱、丙基氨基柱及離子交換柱。

 

 

圖7 常用色譜柱類型列表及對應(yīng)的填料示意圖

 

 

圖8 常用色譜柱對應(yīng)的作用力

 

 

圖9 特征官能團間存在的作用力

 

鍵合不同官能團的色譜柱對應(yīng)的作用力如圖8所示。特征官能團間存在的作用力如圖9所示。當(dāng)色譜柱無法有效分離多個組分時，可根據(jù)組分的特征官能團選擇不同作用力的色譜柱嘗試分離，如鹵代化合物在常規(guī)C18色譜柱上無法分離時，可以嘗試具有強偶極作用力的PFP色譜柱嘗試分離。常見的C18/C8柱存在很強/強的疏水作用以及殘存的硅醇基會帶來弱氫鍵作用力，該類色譜柱對疏水性較強的化合物（LogD＞0）一般會有較好的保留，但在分析堿性化合物時，殘存硅醇基引入的氫鍵作用會導(dǎo)致化合物會產(chǎn)生次級保留，從而造成色譜峰的拖尾，此時多重封端C18色譜柱可加以考慮。如在同一色譜條件下分析如表1所示化合物時，單封端分析弱堿化合物時存在明顯拖尾，嘗試雙封端色譜柱拖尾明顯改善。

 

 

RP-PEG色譜柱，存在較強的疏水作用、氫鍵作用及中等偶極作用，該類色譜柱在分析常規(guī)C18上弱保留或無保留的化合物（LogD＞-0.5）有顯著優(yōu)勢，強氫鍵作用或偶極作用可以彌補疏水作用的不足，從而讓化合物有效保留。如圖9所示，在同一色譜條件下分析硫脲時，常規(guī)C18無法對其產(chǎn)生保留，而選擇AtlantisTM dC18色譜柱時則可對其產(chǎn)生有效保留。

 

 

圖9 常規(guī)C18與AtlantisTM dC18色譜柱同時分析硫脲

 

苯基柱以及五氟苯基柱存在中等強度的疏水作用以及強的π-π作用，此外五氟苯基柱還存在強的偶極作用。當(dāng)在同一色譜條件下分析如表2所示的三個位置異構(gòu)體時，常規(guī)C18無法通過疏水作用將其有效分離，而五氟苯基柱則可通過三者間的π-π作用差異將其有效分離。

 

 

綜上，在了解色譜柱填料差異以及對應(yīng)的作用力差異的基礎(chǔ)上，根據(jù)化合物的特征官能團，快速而準(zhǔn)確的選擇合適的色譜柱往往能起到事半功倍效果。以上均為筆者在工作過程中的個人經(jīng)驗總結(jié)，若有紕漏望同行斧正。