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多肽一般是指少于 100 個氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物，其相對分子質(zhì)量低于10 000。多肽類藥物在治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病、肢端體肥大癥、骨質(zhì)疏松癥、胃腸道疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病以及抗病毒、抗菌等方面具有顯著的療效。多肽如何純化一起來學(xué)習下吧。

凝膠過濾的應(yīng)用

1、生物大分子的純化圖片

凝膠過濾是依據(jù)分子量的不同來進行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點，使得凝膠過濾成為純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對于一些大小不同，但理化性質(zhì)相似的分子，用其他方法較難分開，而凝膠過濾無疑是一種合適的方法，例如對于不同聚合程度的多聚體的分離等。

2、分子量測定

凝膠過濾測定分子量操作比較簡單，所需樣品量也較少，是一種初步測定蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點是測量結(jié)果的準確性受很多因素影響。由于這種方法假定標準物和樣品與凝膠都沒有吸附作用，所以如果標準物或樣品與凝膠有一定的吸附作用，那么測量的誤差就會比較大。計算公式成立的條件是蛋白基本是球形的，對于一些纖維蛋白等細長形狀的蛋白不成立。另外由于糖的水合作用較強，所以用凝膠過濾測定糖蛋白時，測定的分子量偏大，而測定鐵蛋白時則發(fā)現(xiàn)測定值偏小。

3、脫鹽及去除小分子雜質(zhì)

利用凝膠過濾進行脫鹽及去除小分子雜質(zhì)是一種簡便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是Tandex G-25，并且目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，可多次使用。

4、去熱源物質(zhì)

熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物使人體發(fā)熱的物質(zhì)，它們是一類分子量很大的物質(zhì)，所以可以利用凝膠過濾的排阻效應(yīng)將這些大分子熱源物質(zhì)與其他相對分子量較小的物質(zhì)分開。例如對于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質(zhì)，凝膠過濾是一種簡單而有效的方法。

5、溶液的濃縮

利用凝膠顆粒的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮。例如將干燥的Tandex（粗顆粒）加入溶液中，Tandex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質(zhì)也會滲透進入凝膠孔穴內(nèi)部，而大分子則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強度和pH值。

6、蛋白質(zhì)的復(fù)性

為了減少高濃度下的聚集反應(yīng)，凝膠過濾層析技術(shù)也可以用來進行蛋白的體外復(fù)性。層析介質(zhì)的隔離作用，降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集，使復(fù)性濃度、復(fù)性率都得到很大的提高。同時，蛋白經(jīng)過凝膠過濾層析本身也可得到一定的純化。

兩個重要的因素影響凝膠過濾層析復(fù)性蛋白的收率：第一個是變性條件下蛋白質(zhì)的上樣，第二個是復(fù)性緩沖液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。另外，蛋白質(zhì)上樣量也會影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率，因為在層析柱的頂端會因為上樣量的增加而發(fā)生結(jié)構(gòu)的聚集。

為了提高蛋白質(zhì)復(fù)性效率，發(fā)展了一種梯度凝膠過濾層析復(fù)性方法。在色譜柱中預(yù)先設(shè)置變性劑濃度的梯度，當復(fù)性的蛋白質(zhì)進入到柱子中后，由于蛋白質(zhì)的表觀分子量遠遠大于變性劑，從而蛋白質(zhì)經(jīng)過了一個變性劑濃度逐步降低的環(huán)境，蛋白質(zhì)逐步地折疊復(fù)性，從而有效地降低了聚集體的形成，并能把聚集體和折疊的蛋白質(zhì)進行分離。

線性梯度在凝膠過濾層析中可能經(jīng)常會遇到，但是有時有些蛋白質(zhì)可能在某些變性劑濃度下不穩(wěn)定，在梯度過程中需要盡快跨越這些濃度過程；有時蛋白質(zhì)折疊的限速在某些變性劑濃度下，此時需要增加此段的時間，所以在凝膠過濾層析中可以設(shè)計不同類型的梯度形式，以滿足不同的蛋白質(zhì)的復(fù)性需要。

分離純化四大原理

1、反相高效液相色譜

反相高效液相色譜（RP-HPLC）是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑或其水溶液作為流動相，根據(jù)溶質(zhì)疏水性的差別進行分離純化的洗脫色譜法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000的多肽的分離純化，因其具有分離效果好、分辨率高、重復(fù)性好、分析速度快等優(yōu)點，在多肽的分離純化和制備中得到廣泛應(yīng)用。目前 RP-HPLC分離柱是以硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主體。尤其是鍵合 C18 ( Octadecylsilica,ODS )、C8 烷基以及苯基填料的出現(xiàn)，使該技術(shù)得到長足發(fā)展。這類填料的最大特點是顆粒剛性好，有利于傳質(zhì)，可以得到很高的柱效，并有良好的選擇性。

2、離子交換色譜

離子交換色譜（IEXC）是以離子交換劑作為固定相，交換劑由固定離子基團及可交換的平衡離子組成。當流動相帶著組分離子通過離子交換柱時，組分離子與可交換的離子進行可逆變換，最后達到交換平衡。離子交換色譜法的原理就是根據(jù)不同組分離子對固定離子基團的親和力的差別而達到分離的目的。離子交換色譜又可分為陽離子交換色譜和陰離子交換色譜。相對的可選用的有陽離子交換填料和陰離子交換填料。IEXC最為明顯的優(yōu)勢在于它的分離條件最接近生物的生理環(huán)境，對生物分子有一定的兼容性，以便于保存多肽的生物活性。對多肽分子進行分離純化可采用兩種方式，一是將目的產(chǎn)物離子化，被交換到介質(zhì)上，雜質(zhì)不被吸附，從柱流出，稱為“正吸附”。此法優(yōu)點是目的產(chǎn)物純度高，且可達到濃縮目的，宜處理目的產(chǎn)物濃度低且工作液量大的溶液。另一方式是將雜質(zhì)離子化后被交換，而目的產(chǎn)物不被交換直接流出，這種方式稱為“負吸附”。采用此法通?？沙?0%～ 70 %的雜質(zhì)，適用于目的產(chǎn)物濃度高的工作液。以上兩種方式的選擇要依據(jù)樣品及具體要求而定。無論是正吸附還是負吸附，離子交換色譜均已成為多肽化學(xué)中一重要的分離方法。

3、凝膠色譜

凝膠色譜（Gel FiltrationChromatography, GFC)是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)多肽分子的大小、形狀差異進行分離的一種方法。如人重組生長激素 (hGH)的分離，不同結(jié)構(gòu)、構(gòu)型的GH在 GFC 柱上的分離行為完全不同，從而可分離不同構(gòu)型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。凝膠色譜具有很多優(yōu)點：介質(zhì)為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子作用，因此分離條件溫和，產(chǎn)品收率高，生物活性好；工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離從幾百至數(shù)萬分子量的分子。

4、親和色譜

親和色譜（AC）也稱為親和層析，是一種利用固定相與物質(zhì)的特異性結(jié)合來實現(xiàn)分離和純化目的的方法。

HPLC與其他分離純化方法聯(lián)用

肽的種類很多且大多具有相似性，使用單一的分離純化手段已經(jīng)不能達到理想的分離純化效果。HPLC有可以進行大規(guī)模制備等優(yōu)點，但存在費時、價高等缺點。HPLC與其他分離純化方法技術(shù)的聯(lián)用，集中了各種方法的優(yōu)勢，彌補了各技術(shù)的不足，在多肽分離純化中已顯示出巨大的優(yōu)越性。

抓住了以上4點，也就掌握了多肽分離的核心！可以橫掃一切多肽分離的問題啦！