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藥品雜質(zhì)作為影響藥品安全有效性的關(guān)鍵因素，在藥品研究、質(zhì)控過程中發(fā)揮了重要作用。本人從事多年的藥物雜質(zhì)分離純化工作，本文將重點討論藥物雜質(zhì)對照品的制備獲取方法，包括以下三部分內(nèi)容：藥物雜質(zhì)對照品粗品來源；藥物雜質(zhì)對照品純化分離方法；藥物雜質(zhì)對照品制備獲得方法。文末將以實例分享制備獲取過程。

1 藥物雜質(zhì)對照品粗品來源

藥物雜質(zhì)可以分為工藝雜質(zhì)、降解雜質(zhì)、從起始原料或試劑中帶入的雜質(zhì)等。由于藥物雜質(zhì)含量往往較低，無論從中間體、反應(yīng)液或母液提取難度大，獲取成本高，因此快速獲取高含量的雜質(zhì)粗品尤為關(guān)鍵。對于中間體或成品雜質(zhì)，一般參考合成工藝路線，進行破壞性試驗，例如改變反應(yīng)物料的配比、反應(yīng)溫度、后處理方式等?；蛘邊⒖妓幬锓€(wěn)定性影響因素試驗，采用高溫（例如60℃~100℃）、高濕（例如RH90％±5％）、酸堿（例如0.1mol/L-1.0mol/L的鹽酸或氫氧化鈉）、氧化（例如0.1%到3%的過氧化氫）光照等劇烈條件來提高對反應(yīng)物的破壞降解，提高雜質(zhì)含量。另外也可以采用定向合成方法，即需要先反推雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，再而設(shè)計相關(guān)合成路線，待分離純化后，再經(jīng)液質(zhì)分析確認。

小結(jié)：藥物雜質(zhì)對照品粗品來源是制備分離的關(guān)鍵，雜質(zhì)含量低，分離難度大，時間成本高。優(yōu)選定向合成方法，次選破壞性試驗法，以提高雜質(zhì)含量為目的。特殊情況下，對于某些雜質(zhì)無法推導(dǎo)其可能結(jié)構(gòu)或者經(jīng)破壞性試驗雜質(zhì)含量仍較低者，只能通過富集法。

2藥物雜質(zhì)對照品純化分離方法

藥物雜質(zhì)對照品純化分離方法通常包括：結(jié)晶法、柱層析法、制備薄層色譜法、制備色譜法和成鹽法、酸堿法等。由于藥物雜質(zhì)對照品粗品的獲得過程，往往含量較低。因而本文主要討論制備色譜法在分離純化中的應(yīng)用。

2.1 結(jié)晶法

常用的結(jié)晶法有冷卻結(jié)晶法和反溶劑結(jié)晶法。冷卻結(jié)晶法是根據(jù)物質(zhì)在某一溶劑不同溫度下溶解度不同，將待純化物加熱至溶解后，降溫析晶的過程。冷卻結(jié)晶關(guān)鍵在于溶劑的選擇，通常根據(jù)“相似相容”原理。而反溶劑結(jié)晶法指的是選取兩種溶劑（良性溶劑和不良溶劑），將待純化產(chǎn)物溶于良性溶劑再加入不良溶劑析晶的過程。結(jié)晶法主要適用于雜質(zhì)含量比較高的產(chǎn)品（例如定向合成），本文不做重點討論。

2.2 柱層析法

柱層析法即常說的“過柱子”，分離原理是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附能力不同而進行分離，常用的吸附固定相是硅膠和氧化鋁，分離的關(guān)鍵在于裝柱方法（濕法和干法），上樣方法（濕法和干法）和洗脫劑的選擇（溶劑選擇和洗脫方式）。柱層析法具有能耗低、洗脫劑易于回收等優(yōu)點，同時也存在分離過程費時、效率低，對于復(fù)雜化合物純化效果差等缺點。

2.3 制備薄層色譜法

制備薄層色譜法（爬大板法）可以快速分離反應(yīng)體系混合物的多種成分，是一種實用快速獲取少量對照品的方法。制備薄層色譜法操作流程主要包括：硅膠板的選擇（通常自制、厚度好）、樣品上樣、洗脫展開、色帶檢測、刮板溶解。制備薄層色譜法雖然操作方便，設(shè)備簡單，但仍存在樣品處理量小的缺點。

2.4 制備液相色譜法

制備液相色譜法是一種具有高靈敏度、高選擇性的快速分離技術(shù)，其目的是對產(chǎn)品進行快速分離純化。在純度、收率、分離效率等方面遠優(yōu)于傳統(tǒng)的制備方法，已廣泛地應(yīng)用于藥物研究的分離和純化。

2.4.1制備液相色譜和分析液相色譜的比較

制備液相色譜法分為正相制備色譜和反相制備色譜兩種。其中反相制備色譜使用廣泛，固定相一般采用反相填料（C18、C8）等，藥物的分離純化多采用以C18為填料的反相色譜柱。與分析液相用于對樣品進行定量和定性不同，制備液相的目的是對特定組分進行分離和純化，不需要很高的精密度和準確度。

2.4.2制備液相色譜的進樣操作

制備液相為了提高制備量，經(jīng)常采用超載進樣。超載方式有兩種，一種是“濃度超載”，即待純化物質(zhì)溶解于較小的進樣體積，提高進樣濃度；另一種是“體積超載”，即將待純化物質(zhì)溶解于較大量的進樣體積，減少進樣濃度。濃度超載和體積超載都將導(dǎo)致化合物分離度的降低。樣品在流動相中具有足夠溶解度情況下，優(yōu)選濃度超載法。通過建立合適的制備方法分離化合物峰，經(jīng)過檢測器時被檢測到并收集起來，進而通過蒸發(fā)或冷凍干燥除去流動相而得到純品。

2.4.3制備液相色譜方法的建立和注意事項

2.4.3.1了解待純化樣品的相關(guān)物性

了解雜質(zhì)粗品的來源，通過定向合成、破壞降解或母液濃縮富集，初步了解其中可能含有的化合物。利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，檢測分析樣品的分子量和分離情況。對于經(jīng)酸堿破壞降解的雜質(zhì)粗品液，可以通過比較不同時間段，放置于不同環(huán)境溫度，考察目標雜質(zhì)含量變化情況，了解雜質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，為后期去除流動相提供基礎(chǔ)理論。

2.4.3.2 待純化樣品的預(yù)處理

雜質(zhì)樣品往往來源復(fù)雜，含有不可逆吸附作用物質(zhì)，一方面容易堵塞污染柱子，另一方面降低柱使用壽命，影響重現(xiàn)性。因而，必要的前處理如萃取、過濾、析晶、等分離方法尤為重要。另外，關(guān)注分離體系是否含有重金屬類物質(zhì)，樣品溶液進樣是否需要調(diào)節(jié)Ph等。

2.4.3.3 建立初步制備分離方法

根據(jù)目標化合物結(jié)構(gòu)，推測其極性大小，采用等度或梯度洗脫方法摸索保留時間。關(guān)注待分離目標化合物與其前后雜質(zhì)的分離度，而不要求在分析柱上得到所有組分的基線分離。流動相中水相調(diào)節(jié)劑常加入：甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等，有機相常使用乙腈和甲醇。制備分離方法的初步建立，在于摸索從分析方法到制備方法的區(qū)別，需要確保所有雜質(zhì)全部洗脫。

2.4.3.4 制備方法的優(yōu)化

優(yōu)化方向的目的：回收率和純度。建立了初始的制備方法后，確定了目標雜質(zhì)峰的位置以及整個洗脫體系的情況后，為了節(jié)約時間和成本，我們只關(guān)注目標雜質(zhì)和相鄰雜質(zhì)的分離情況，而經(jīng)常采取濃度超載或體積超載進樣。制備中常常因為超載而無法使目的物與鄰近雜質(zhì)間達到完全基線分離，可以優(yōu)化出峰時間，采用分段收集的方法得到指定純度的目的物。對于體系復(fù)雜者，可以二次制備純化。

3藥物雜質(zhì)對照品制備獲得方法

對于定向合成方法，往往能得到較高含量的目標雜質(zhì)，這種情況下，通常采用萃取法或結(jié)晶法，減壓濃縮除去溶劑或過濾洗滌烘干，即可得目標雜質(zhì)對照品。需要注意的是，雜質(zhì)對照品往往不穩(wěn)定，盡量快速低溫制備烘干，最后保存于低溫冰箱。通過柱層析法或制備薄層色譜法分離的雜質(zhì)，通常也是低溫快速減壓濃縮至干，低溫冰箱保存。而對于含量較低的雜質(zhì)粗品而言，通過制備液相色譜法得到的制備液。對于弱極性物質(zhì)，可以先減壓去除乙腈，再萃取濃縮至干；對于水溶性強的物質(zhì)，可以采用不含鹽的水相-有機相再次制備除去緩沖鹽，最后采取低溫旋除水或冷凍干燥法去除水，即可得到目標雜質(zhì)。

實例分享：含有β-內(nèi)酰胺類抗生素開環(huán)物的制備獲取過程

開環(huán)物雜質(zhì)溶液獲取方法

根據(jù)文獻，可知β-內(nèi)酰胺是指一類含有四元內(nèi)酰胺環(huán)的有機結(jié)構(gòu)，在酸堿條件下容易開環(huán)。因而優(yōu)選酸-堿破壞法（0.1mol/L-1.0mol/L鹽酸或氫氧化鈉水溶液），調(diào)整物料比和反應(yīng)時間（減少副產(chǎn)物例如聚合物的產(chǎn)生）即可得含量較高的雜質(zhì)溶液；

開環(huán)物雜質(zhì)溶液的純化分離方法

得到開環(huán)物雜質(zhì)溶液后，需要調(diào)節(jié)反應(yīng)液Ph至中性左右，以終止反應(yīng)。因而體系中引入了無機鹽和其他可能雜質(zhì)。開環(huán)物含有羧基和仲氨基，易溶于水。純化分離優(yōu)選反相制備色譜，一方面可以出去可溶性鹽，另一方面可以進一步提高純度。

反相制備色譜方法的建立

以分析液相（4.6*250mm-5μm）為例，可檢測目標雜質(zhì)的極性和相鄰雜質(zhì)情況，制備方法的建立以21.2*250mm-5μm制備柱為例，流動相以純化水和乙腈為例，以平行放大原理，

其中，V2、r2、L2分別為制備色譜的流量、內(nèi)徑、柱長；V1、r1、L1分別為分析色譜的流量、內(nèi)徑、柱長；建立初始方法，然后超載進樣，優(yōu)化方法，收集制備液，經(jīng)液相分析，純度滿足后，連續(xù)進樣，得到不含鹽的水相制備液。

水相制備液的后處理

得到符合純度要求的水相制備液后，通常先低溫旋除有機溶劑，然后依據(jù)雜質(zhì)穩(wěn)定性，選擇低溫濃縮至干或冷凍干燥，即得雜質(zhì)對照品。最后低溫冰箱密封保存。

總結(jié)：藥物雜質(zhì)對照品在質(zhì)量研究中不可或缺。然而由于含量低，獲取難等原因，目前市場上雜質(zhì)對照品價格昂貴，增大藥企研發(fā)成本。制備液相色譜在純化分離有著顯著的優(yōu)勢。