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抗體的功能性取決于靶點(diǎn)的有效選擇。膜蛋白作為治療性抗體的靶點(diǎn)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)輸中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可用于疾病診斷及藥物治療領(lǐng)域。當(dāng)前，膜蛋白在藥物研發(fā)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)是需要進(jìn)一步發(fā)掘膜蛋白潛在靶點(diǎn)的干預(yù)價(jià)值，開發(fā)治療性抗體藥物；而若要開發(fā)針對(duì)復(fù)雜膜蛋白（如GPCR、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和激酶）的抗體藥物，必須從抗原靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、抗體篩選策略、先導(dǎo)抗體優(yōu)化及藥物研發(fā)模式方面進(jìn)行考慮。 

 

中國工程院院刊《Engineering》2021年第11期刊發(fā)美國德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心安志強(qiáng)教授研究團(tuán)隊(duì)的《靶向膜蛋白的抗體藥物開發(fā)的新進(jìn)展》一文。文章概述了抗體靶向復(fù)雜膜蛋白的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)，總結(jié)了膜蛋白抗原制備和抗體研發(fā)策略的最新進(jìn)展。文章指出，膜蛋白的抗原制備作為關(guān)鍵技術(shù)之一，是開發(fā)有功能的靶向抗體的前提條件；第二個(gè)關(guān)鍵技術(shù)涉及抗體優(yōu)化和抗體表達(dá)平臺(tái)。抗體與小分子和多肽藥相比有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，膜蛋白參與了各種正常生理過程，其功能異常與多種疾病相關(guān)。此外，重點(diǎn)研究膜蛋白分子的抗體開發(fā)，將為一系列疾病診斷和治療帶來新的突破；需要制定選擇靶向膜蛋白的指南，其中篩選治療靶點(diǎn)進(jìn)行單抗研發(fā)是未來技術(shù)革新的重要方向。

 

一、引言

 

根據(jù)抗體協(xié)會(huì)（Antibody Society）的名單，截至2021年9月，有127種抗體在美國和歐盟上市。其中，超過一半（77/127）以膜蛋白為靶標(biāo)。然而，這些抗體中的大多數(shù)都是靶向具有簡單跨膜區(qū)和較長胞外區(qū)（ECD）的膜蛋白，如酪氨酸激酶受體。僅有三種靶向結(jié)構(gòu)復(fù)雜的膜蛋白，如G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。值得注意的是，獲批藥物中約40%通過靶向GPCR復(fù)合物發(fā)揮藥理作用，體現(xiàn)了膜蛋白類治療性抗體的開發(fā)潛力。事實(shí)上，離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、GPCR和激酶是藥物研發(fā)中最大的一類藥物靶點(diǎn)。

 

業(yè)界和相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)已有多篇關(guān)于膜蛋白抗體的優(yōu)秀綜述。本文主要探討治療性抗體研發(fā)現(xiàn)狀和技術(shù)革新，以致力于研發(fā)和識(shí)別更復(fù)雜的膜蛋白抗體，包括GPCR、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和激酶。GPCR和離子通道是小分子化合物重要的作用靶點(diǎn)。分析2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，GPCR和離子通道在小分子治療藥物中分別占比33%和18%。GPCR和離子通道是生物醫(yī)藥研究和臨床研發(fā)高度關(guān)注的熱點(diǎn)。如何選擇膜蛋白靶點(diǎn)是小分子藥物開發(fā)中遇到的一個(gè)關(guān)鍵問題，雖然小分子比抗體更容易到達(dá)作用部位，但抗體能有效識(shí)別復(fù)雜膜蛋白的胞外區(qū)。以CC趨化因子受體4（CCR4）為例，該基因編碼的蛋白屬于GPCR家族，CCR4抗體mogamulizumab批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性蕈樣真菌病和Sézary綜合征。另一個(gè)例子是預(yù)防偏頭痛的藥物erenumab，其抑制了降鈣素基因相關(guān)肽受體（CGRPR）的生物活性。靶向膜蛋白的抗體制備策略之一是抗體工程化改造。當(dāng)特定蛋白構(gòu)象改變與疾病狀況相關(guān)時(shí)，抗體藥物在選擇性、特異性和效應(yīng)功能方面具有許多額外的優(yōu)勢(shì)，單克隆抗體BIL010t靶向非功能性的胞外ATP激活離子通道無功能的嘌呤受體P2X7（nfP2X7），目前正在利用該抗體進(jìn)行治療基底細(xì)胞癌的臨床試驗(yàn)。抗體偶聯(lián)藥物通過改善藥代動(dòng)力學(xué)增加了藥物活性， Gptx-1多肽毒素偶聯(lián)抗體在有效阻斷Nav1.7離子通道的同時(shí)延長了抗體半衰期，并能更好地作用于神經(jīng)纖維。除了直接作用外，抗體還可以通過抗體依賴的細(xì)胞毒（ADCC）和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒（CDC）等效應(yīng)發(fā)揮功能。利用mogamulizumab證明了可通過改造抗體可結(jié)晶片段（Fc）區(qū)來提高藥效和安全性。

 

蛋白質(zhì)晶體技術(shù)和其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段有助于我們更好地解析膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)。模擬膜蛋白天然結(jié)構(gòu)制備環(huán)狀多肽抗原，從而成功研發(fā)靶向這些蛋白的治療性抗體。抗體的分離純化也得益于技術(shù)進(jìn)步，大腸桿菌GroEL作為分子佐劑進(jìn)行DNA免疫，誘導(dǎo)了針對(duì)靶向蛋白的特異性抗原，提高DNA免疫在體內(nèi)激發(fā)抗體產(chǎn)生的效率。

 

膜蛋白靶向抗體藥物的發(fā)展經(jīng)歷了四個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。第一是分離穩(wěn)定天然蛋白構(gòu)象的抗原；第二是克服免疫耐受，即免疫系統(tǒng)對(duì)類似自身抗原結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生免疫應(yīng)答；第三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)則需要考慮這些靶分子多樣化的胞外區(qū)（抗體的作用區(qū)域）；第四是篩選有效作用于膜蛋白功能位點(diǎn)的特定抗體。不同的研發(fā)策略以及新技術(shù)和新方法正被用于解決上述關(guān)鍵技術(shù)以開發(fā)更高效的抗體藥物。表1列出了正在進(jìn)行臨床前研究和已用于臨床治療的膜蛋白靶點(diǎn)抗體藥物。我們根據(jù)靶點(diǎn)類型、抗原結(jié)構(gòu)、抗體形式和抗體生產(chǎn)平臺(tái)將這些抗體進(jìn)行分類，并給出配體、結(jié)合位點(diǎn)、作用機(jī)制、有效性、表位、治療適應(yīng)癥和副作用等詳細(xì)信息（表1）。

 

表1 靶向膜蛋白抗體研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)及面臨的挑戰(zhàn) 

 

 

抗體工程技術(shù)提高了抗體結(jié)合靶抗原的特異性和有效性。改造抗體Fc區(qū)，能夠減緩抗體藥物的半衰期。此外，F(xiàn)c區(qū)工程化改造還可以增強(qiáng)或減弱ADCC等Fc效應(yīng)。膜蛋白通過其配體或其他相互作用的蛋白激活下游信號(hào)通路。許多膜蛋白抗體可有效識(shí)別并穩(wěn)定GPCR和離子通道的結(jié)構(gòu)域，影響其參與的多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

 

ClinicalTrials.gov、PubMed數(shù)據(jù)庫和抗體協(xié)會(huì)的相關(guān)資料給出了目前處于臨床前和臨床開發(fā)中的膜蛋白靶向抗體，本文挑選了其中具有代表性的例子，探討了靶向膜蛋白抗體的作用機(jī)制、膜蛋白抗原的制備以及抗體的研制。

 

二、膜蛋白抗體的作用機(jī)制

 

GPCR的胞外區(qū)介導(dǎo)受體與配體相互作用，激活的受體將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)并招募下游效應(yīng)蛋白。離子通道在細(xì)胞膜上形成一個(gè)孔道，疏水性氨基酸面向磷脂雙層，離子可以通過這個(gè)通道穿過細(xì)胞膜的疏水核心。離子通道、GPCR和其他跨膜蛋白參與了許多重要的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，其功能異常與多種疾病有關(guān)。因此，以它們?yōu)榘悬c(diǎn)開發(fā)的抗體在治療和預(yù)防相關(guān)疾病方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。研發(fā)膜蛋白治療性抗體的幾個(gè)要素：結(jié)構(gòu)高度保守是機(jī)體維持正常功能不可或缺的，因此針對(duì)這些靶點(diǎn)的干預(yù)手段具有更廣的選擇性；跨膜蛋白（離子通道，GPCR）和膜結(jié)合的激酶（基質(zhì)金屬蛋白酶）的結(jié)構(gòu)多樣性，為干預(yù)調(diào)節(jié)這些蛋白的特定功能提供了許多思路，更易于研發(fā)靶向特異性的治療抗體；通過多種方式優(yōu)化改造抗體自身復(fù)雜的結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)出針對(duì)多靶點(diǎn)的單抗藥物。

 

膜蛋白抗體與GPCR的結(jié)構(gòu)及可能的互作位點(diǎn)如圖1（a）所示。單抗與GPCR相互作用的一種方式是維持其活性狀態(tài)。一項(xiàng)關(guān)于GPR56的研究利用激發(fā)型抗體闡明了GPCR信號(hào)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。另外一種效果是單抗促進(jìn)GPCR形成二聚體功能單元，研究人員發(fā)現(xiàn)代謝型谷氨酸受體7和β1腎上腺素能受體通過識(shí)別二聚體可有效激活GPCR。相對(duì)地，阻斷型抗體可作為一種GPCR抑制劑，GIP是葡萄糖依賴性促胰島素多肽，通過干預(yù)GIP-GIPR這一路徑，有望治療肥胖癥和糖尿病患者。Mogamulizumab是靶向CCR4的人源化單克隆抗體，2018年被批準(zhǔn)用于治療淋巴瘤、Sézary綜合征和蕈樣真菌病，但未表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)或抑制GPCR活性效應(yīng)。Mogamulizumab通過清除腫瘤微環(huán)境中表達(dá)CCR4的腫瘤細(xì)胞以及腫瘤浸潤的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮作用，通過Fc去巖藻糖基化加強(qiáng)了ADCC效應(yīng)。靶向GPCR的單抗erenumab是一種降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）抑制劑，結(jié)合和拮抗降鈣素基因相關(guān)肽受體（CGRPR），2018年已被批準(zhǔn)用于預(yù)防成人偏頭痛。離子通道系列抗體的效應(yīng)途徑如圖1（b）所示；抗體誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體產(chǎn)生內(nèi)化，鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1（Orai-1）與自身免疫炎性疾病相關(guān)，Orai-1蛋白形成了細(xì)胞膜鈣離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于T細(xì)胞活化和功能是必需的。針對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的膜蛋白靶點(diǎn)開發(fā)的單克隆抗體能夠識(shí)別特殊構(gòu)象[圖1（c）]，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT4）單抗分為向內(nèi)開放和向外開放的構(gòu)象狀態(tài)，對(duì)葡萄糖的攝取和代謝至關(guān)重要?？贵w作用于膜結(jié)合激酶，通過改變重鏈長CDR-H3區(qū)域，到達(dá)配體結(jié)合位點(diǎn)以催化目標(biāo)蛋白酶[圖1（d）]。具有超長CDR-H3的抗體來源于免疫駱駝血清，或人工合成的CDR-H3類似結(jié)構(gòu)?；|(zhì)金屬蛋白酶-14（MMP-14）就是一個(gè)長CDR-H3靶向作用的膜蛋白位點(diǎn)。人apelin受體（APJ）是慢性心力衰竭患者的治療靶點(diǎn)。靶向apelin受體的抗體JN241-9屬于A類GPCR，其N末端胞外區(qū)比B類GPCR更短。駱駝單域抗體突變體JN241-9是首個(gè)GPCR抗體激動(dòng)劑，相對(duì)較長的CDR3區(qū)域易于與疏水核心結(jié)合。已有研究報(bào)道，治療性抗體MEDI9447通過穩(wěn)定非激活狀態(tài)的構(gòu)象和交聯(lián)CD73二聚體，拮抗胞外5´-核苷酸酶（ecto-5´-nucleotidase, CD73）活性[圖1（d）]。

 

 

圖1 靶向膜蛋白的抗體作用機(jī)制。（a）抗體激活GPCR，作為配體活化或促二聚化；抗體抑制GPCR，如與配體競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)。（b）促進(jìn)內(nèi)化是抗體靶向離子通道的一種方式。（c）靶向特定功能狀態(tài)的特異性抗體，靶向細(xì)胞攝取葡萄糖的向內(nèi)和向外開放狀態(tài)。（d）左側(cè)圖表示抗體針對(duì)MMP-14的結(jié)合部位，右側(cè)圖為通過穩(wěn)定無活性的構(gòu)象（如CD73二聚體）來抑制酶的活性。

 

三、抗原制備

 

抗原制備是研制特異性調(diào)節(jié)膜蛋白功能的候選抗體的首要條件。理想的抗原應(yīng)該包含與靶蛋白功能相關(guān)的所有關(guān)鍵位點(diǎn)，因此，膜蛋白抗原需具有相關(guān)作用的完整構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄后修飾；雖然不需要蛋白的完整分子，但抗體靶向表位的相關(guān)區(qū)域是必不可少的。

 

為了便于大量生產(chǎn)有活性功能的抗原，我們常常對(duì)抗原的某些結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，這些改變應(yīng)注意保留蛋白結(jié)構(gòu)的完整性和生物活性，包括整體構(gòu)象、配體結(jié)合、膜表達(dá)、抗原加工和相關(guān)表位。選擇治療性抗體的靶點(diǎn)因不同種類的膜蛋白而有所差異，一般情況下，抗原識(shí)別位點(diǎn)在胞外環(huán)區(qū)和靠近N末端部位。膜蛋白胞內(nèi)段是維持其結(jié)構(gòu)和信號(hào)的傳導(dǎo)區(qū)，如靶向GLUT4胞內(nèi)功能區(qū)的LM043。膜結(jié)合激酶抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶與底物的作用部位，抗apelin受體的JN241-9識(shí)別受體-配體結(jié)合位點(diǎn)?？贵w藥物偶聯(lián)需要設(shè)計(jì)特定的抗原結(jié)合片段，單抗通過一個(gè)化學(xué)鏈與生物活性小分子藥物相連，抗體和小分子作用于不同的靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。鑒于膜蛋白的分子量和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，靶向這些蛋白的抗體必須覆蓋廣泛的抗原表位?？乖谋磉_(dá)形式同樣遵循一定的策略，充分了解靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，可參考已有抗體的類似靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)。膜蛋白靶標(biāo)的分類基于蛋白行使功能的方式，如用離子通道的生理功能區(qū)分刺激-分泌耦合，根據(jù)序列、功能和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)GPCR進(jìn)行分組。開發(fā)新型抗原是探索膜蛋白生物功能和新藥創(chuàng)制的突破口（圖2）。新型的杯芳烴基表面活性劑和Salipro納米膜技術(shù)為穩(wěn)定生產(chǎn)膜蛋白抗原提供了新思路。

 

 

圖2 選擇抗原形式。（a）最簡單的抗原形式是多肽，可以通過化學(xué)鍵或環(huán)化等方法形成穩(wěn)定多肽；（b）細(xì)胞表達(dá)靶分子膜蛋白；（c）脂質(zhì)納米圓盤保留了膜蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，避免產(chǎn)生非特異性抗體；（d）病毒樣顆粒是一種保持膜蛋白天然構(gòu)象產(chǎn)生抗原蛋白的方法；（e）用編碼膜蛋白的DNA序列免疫動(dòng)物提高動(dòng)物免疫效率。

 

（一）多肽

 

多肽是最簡單的抗原形式，成本低且易于大量生產(chǎn)。以下三種情況首選多肽抗原：①抗體只需要與受體結(jié)合就能阻斷特定細(xì)胞功能；②目標(biāo)細(xì)胞的靶分子胞外N末端直接參與其功能；③膜蛋白有較長的胞外區(qū)。GPCR靶向單克隆抗體（抗CCR4）和鈣離子通道Orai-1抗體就使用了多肽抗原。之前的研究表明，讓鏈狀的多肽成環(huán)約束了多肽的活動(dòng)，可獲得與天然構(gòu)象相似的穩(wěn)定抗原[圖2（a）]。例如，通過化學(xué)鍵將多肽裝入CLIPS骨架，這項(xiàng)技術(shù)已成功用于趨化因子受體-2（CXCR2）抑制劑的研發(fā)。N末端未經(jīng)修飾的線性多肽容易受到肽鏈外切酶的識(shí)別，改造后的環(huán)狀多肽避免了酶降解失活，提高了多肽分子的穩(wěn)定性[圖2（a）]。

 

（二）細(xì)胞表達(dá)的模型多肽或蛋白

 

細(xì)胞膜的脂質(zhì)環(huán)境保證了膜蛋白的正確折疊和活性，因此制備天然構(gòu)象的膜蛋白抗原更易獲得具有治療功能的膜蛋白抗體。常用的方法有細(xì)胞表達(dá)多肽片段或靶蛋白、利用納米盤制備膜蛋白抗體、利用具有較強(qiáng)免疫原性的病毒樣顆粒和DNA免疫技術(shù)制備膜蛋白抗體。

 

利用細(xì)胞表達(dá)膜蛋白，必須保證宿主細(xì)胞產(chǎn)生有功能性的、正確折疊的抗原蛋白，并具備必要的翻譯后修飾[圖2（b）]，同時(shí)選擇適合高密度培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)量高的細(xì)胞系。MaxCyte瞬時(shí)電轉(zhuǎn)染可快速生產(chǎn)大量抗原蛋白，對(duì)于轉(zhuǎn)染率較低的表達(dá)載體也能純化得到一定數(shù)量的膜蛋白?？垢缓涟彼嶂貜?fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5（LGR5）單克隆抗體就是通過將LGR5多肽與受體活性修飾蛋白（RAMP）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞來表達(dá)LGR5抗原。宿主細(xì)胞表達(dá)GPCR多肽或蛋白的細(xì)胞免疫方案也被用于研制離子通道抗體，合成Orai-1和P2X7多肽免疫動(dòng)物，獲得了離子通道的阻斷型抗體。Orai-1單抗可治療自身免疫性疾病患者，P2X7阻斷劑對(duì)炎癥性疾病有療效。

 

（三）純化膜蛋白技術(shù)——脂質(zhì)納米圓盤（nanodisc）和苯乙烯馬來酸脂質(zhì)顆粒（SMALP）

 

我們通常使用生物去垢劑分離和提純膜蛋白，突變可以使去垢劑中的蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。新型的納米圓盤或脂盤可以提高膜蛋白折疊的準(zhǔn)確率。APJ蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)并在納米圓盤和脂質(zhì)體中進(jìn)行高水平重組，成功獲得功能性APJ激動(dòng)型抗體。SMALP溶劑也具有類似的效果。納米圓盤和SMALP作為新型的膜蛋白表達(dá)技術(shù)，替代了傳統(tǒng)去垢劑。納米圓盤由支架蛋白和磷脂分子構(gòu)成了類似磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，膜蛋白整合到納米圓盤上[圖2（c）]，最大限度保留了蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和抗體識(shí)別的重要位點(diǎn)。

 

（四）病毒樣顆粒和蛋白脂質(zhì)體

 

其他模擬天然膜蛋白的抗原包括病毒樣顆粒（VLP），是一種基于雙層脂質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)，與納米圓盤相比，它更趨近于天然細(xì)胞膜。病毒表達(dá)抗原蛋白技術(shù)與免疫方案的優(yōu)化已被廣泛用于靶向膜蛋白（GPCR、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）抗體的研發(fā)。用VLP表達(dá)抗原[圖2（d）]免疫動(dòng)物（雞），獲得了依賴型GLUT4抗體，用于研究GLUT4的生物學(xué)特性和糖尿病治療。

 

（五）DNA免疫

 

在宿主體內(nèi)注射編碼抗原蛋白的DNA載體，使宿主既能表達(dá)膜蛋白，又產(chǎn)生針對(duì)該蛋白的抗體[圖2（e）]。基因槍包被DNA顆粒，將其直接打入細(xì)胞并提呈給免疫細(xì)胞，輔以佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)。β1-腎上腺素受體單抗通過互補(bǔ)DNA（cDNA）免疫聯(lián)合注射類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StaR）增強(qiáng)動(dòng)物免疫反應(yīng)。大腸桿菌熱休克蛋白作為DNA免疫的分子佐劑，與內(nèi)皮素受體蛋白ETAR共同發(fā)揮作用。

 

四、抗體研制

 

膜蛋白作為治療性抗體的靶點(diǎn)，可用于疾病診斷和治療領(lǐng)域。其所面臨的關(guān)鍵技術(shù)包括分析靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、抗原制備方法，以及抗體的分離和純化。膜蛋白抗體的技術(shù)瓶頸阻礙了抗體從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用。

 

抗體研發(fā)人員需具備發(fā)現(xiàn)和開發(fā)不同靶分子抗體的技術(shù)、多樣化的抗體分離純化策略、親和力成熟手段、人源化技術(shù)、ADCC增強(qiáng)技術(shù)等系統(tǒng)性優(yōu)化抗體的工藝（圖3）。

 

 

圖3 膜蛋白抗體的來源。（a）多樣化的候選抗體：免疫動(dòng)物或構(gòu)建天然或合成抗體文庫。常用的動(dòng)物有野生型小鼠、靶蛋白缺陷小鼠、人源化小鼠，特殊的免疫動(dòng)物有綿羊、雞、駱駝。人供體來源的單抗及其結(jié)構(gòu)和功能分析構(gòu)建天然或合成抗體庫，克隆單抗的可變區(qū)序列并裝入載體進(jìn)行真核表達(dá)。（b）第二階段是通過篩選噬菌體文庫、傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)、B細(xì)胞克隆方法，從大量候選抗體中分離出最有希望大規(guī)模生產(chǎn)的單抗。（c）在候選抗體中進(jìn)一步通過基因工程技術(shù)（去糖基化和構(gòu)建不同形式的抗體）優(yōu)化抗體功能，產(chǎn)生不同免疫球蛋白G（IgG）亞型的單抗、抗原結(jié)合片段（Fab）抗體、單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、雙特異性抗體以及抗體偶聯(lián)藥物、寡核苷酸或放射性元素。RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；FUT8：α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。

 

開發(fā)先進(jìn)的抗體研發(fā)技術(shù)有助于更高效地進(jìn)行抗體分離，抗體分離技術(shù)的進(jìn)步也推動(dòng)了開發(fā)難度較高的膜蛋白抗體的研發(fā)進(jìn)展。

 

（一）源于動(dòng)物和文庫的抗體——稀有抗體的獲得

 

抗原免疫動(dòng)物是獲得抗體的重要手段，因此宿主動(dòng)物的選擇也是重要的一環(huán)[圖3（a）]。野生型老鼠是一種常用動(dòng)物，GPCR S1P3是脂質(zhì)信號(hào)分子。通過S1P3肽段免疫小鼠研制的EDD 7H9單抗對(duì)S1P3受體有拮抗作用，能夠抑制小鼠乳腺腫瘤生長及緩解敗血癥。前文提到的Orai-1是鈣釋放激活通道調(diào)節(jié)分子，小鼠抗Orai-1單克隆抗體用于治療自身免疫性疾病。合成Orai-1胞外環(huán)（ECL2）多肽免疫野生型BALB/c小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生靶向Orai-1的阻斷抗體。另外采用過表達(dá)Orai-1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞免疫人源小鼠產(chǎn)生了靶向Orai-1 ECL2段的抗體。

 

除了野生型BALB/c小鼠，我們還會(huì)用到靶蛋白缺陷型小鼠。胰高血糖素樣肽受體（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP1R）是治療2型糖尿病的有效靶點(diǎn)。GMA102和GMA105單抗針對(duì)GLP1R位點(diǎn)，純化的GLP1R蛋白胞外段免疫GLP1R基因敲除小鼠，隨后將抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）序列連接載體，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞HEK293-6E，表達(dá)目標(biāo)單抗并鑒定其功能。目前兩種單抗已經(jīng)進(jìn)入臨床I期，用于治療2型糖尿病和肥胖癥患者。

 

除了野生型小鼠和特定靶蛋白缺陷小鼠外，我們還可以通過具有人免疫球蛋白基因的小鼠模型獲得全人源抗體。這類基因工程小鼠在保留小鼠免疫系統(tǒng)的同時(shí)，產(chǎn)生人源抗體。Douthwaite等使用VelocImmune小鼠平臺(tái)開發(fā)了抗甲酰肽受體1 （FPR1）的治療性單克隆抗體，并采用噬菌體文庫完成抗體親和力成熟。FPR1單抗被用于治療炎癥相關(guān)疾病。通過將純化多肽注射到轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，對(duì)GPCR抗體erenumab和REMD-477進(jìn)行血漿分離并篩選高親和力的人源抗體。Orai-1人源抗體也來源于血漿純化。全人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)Medarex KM被用于研制C-X-C基序趨化因子受體4（CXCR4）抑制劑ulocuplumab。該抑制劑正在進(jìn)行臨床I期試驗(yàn)，用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。

 

研發(fā)難以獲得的膜蛋白單抗，往往需要選擇非小鼠的特定的免疫動(dòng)物。Biosceptre公司的nfP2X7抗體通過了治療基底細(xì)胞癌患者的I期臨床試驗(yàn)，nfP2X7是三磷酸腺苷（ATP）門控離子通道P2X7的一種異構(gòu)體，nfP2X7蛋白具有裸露在外的一段特殊肽段，利用這段多肽結(jié)構(gòu)免疫綿羊產(chǎn)生特異性抗體。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，雞與人同源性較遠(yuǎn)，因此免疫雞分離候選抗體有著廣闊的應(yīng)用前景。駱駝血清是納米抗體的來源，CX3CR1是一種參與CD8+T細(xì)胞募集的趨化因子受體，與腎臟疾病相關(guān)。CX3CR1抗體分離自駱駝?？寺●橊剢慰箍勺儏^(qū)基因，構(gòu)建噬菌體抗體庫，以Apelin受體APJ為靶點(diǎn)，在構(gòu)建的抗體展示文庫中分離APJ激動(dòng)型抗體。構(gòu)建人源抗體以及合成抗體的噬菌體文庫[圖3（a）]是研制膜蛋白抗體的有效途徑。人源抗體文庫從人供體分離B淋巴細(xì)胞，再提取可變區(qū)序列。人工合成抗體文庫則根據(jù)生物信息學(xué)的結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計(jì)有效的抗體序列，將擴(kuò)增或人工合成的抗體CDR序列克隆到載體上，轉(zhuǎn)染表達(dá)宿主。

 

各種動(dòng)物來源抗體都可以通過雜交瘤技術(shù)或B細(xì)胞克隆分離出具有特定功能的罕見單抗[圖3（b）]。傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與分泌特異性抗體的B細(xì)胞融合，篩選雜交瘤細(xì)胞分泌單抗，識(shí)別特定抗原蛋白。

 

（二）抗體形式的修飾

 

獲得針對(duì)復(fù)雜膜蛋白的抗體后，隨之必須解決的問題是治療性抗體形式的精細(xì)化改造，以進(jìn)一步提高療效和特異性。圖3（c）提供了一些精細(xì)化方法。例如，糖工程化技術(shù)敲除α-1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（FUT8）基因，去除了抗體Fc段的巖藻糖，去糖基化抗體對(duì)Fc受體具有更高的親和力，增強(qiáng)了單抗藥物的ADCC和CDC活性。采用無核心巖藻糖單抗的POTELLIGENT®技術(shù)，在FUT8的敲除細(xì)胞中表達(dá)的mogamulizumab單抗是第一款去糖基化修飾的抗體藥物。

 

抗體形式精細(xì)化的另一途徑是，可以使用不同形式的抗體，研制針對(duì)復(fù)合物或復(fù)雜膜蛋白的抗體藥物，如不同的IgG亞型、抗原結(jié)合片段（Fab）、單鏈抗體片段（ScFv）、單域抗體、納米抗體、雙特異性抗體和偶聯(lián)抗體[圖3（c）]。

 

五、總結(jié)

 

本文討論了近年來抗體工程的技術(shù)革新以及靶向膜蛋白的治療性抗體的研究進(jìn)展。膜蛋白的抗原制備作為關(guān)鍵技術(shù)之一，是開發(fā)有功能的靶向抗體的前提條件。第二個(gè)關(guān)鍵技術(shù)涉及抗體優(yōu)化和抗體表達(dá)平臺(tái)?？贵w與小分子和多肽藥相比有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，膜蛋白參與了各種正常生理過程，其功能異常與多種疾病相關(guān)。因此，重點(diǎn)研究膜蛋白分子的抗體開發(fā)，將為一系列疾病診斷和治療帶來新的突破。治療性抗體領(lǐng)域的新興技術(shù)層出不窮，本文或許無法一一探討，文中列舉的技術(shù)方法是基于作者對(duì)治療性抗體開發(fā)的理解和概括，希望對(duì)改進(jìn)靶標(biāo)抗原制備和抗體生產(chǎn)優(yōu)化提供參考。

 

另外，需要制定選擇靶向膜蛋白的指南。篩選治療靶點(diǎn)進(jìn)行單抗研發(fā)是未來技術(shù)革新的重要方向。結(jié)合臨床試驗(yàn)和親和力測(cè)定，進(jìn)而在體內(nèi)外驗(yàn)證抗體活性?？贵w的功能性取決于靶點(diǎn)的有效選擇，抗原結(jié)構(gòu)的微小變化影響了單抗的特異性識(shí)別。例如，為了抑制鈣釋放激活通道Orai-1（其目的是緩解自身免疫性疾病），抗體的體外檢測(cè)涉及鈣離子流量、電流幅度、細(xì)胞周期分析、T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子檢測(cè)。利用人源化移植物抗宿主?。℅VHD）小鼠模型在體內(nèi)觀察Orai-1抑制劑治療GVHD的效果。通過對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研制人Apelin受體激動(dòng)劑抗體JN241-9，進(jìn)而測(cè)定環(huán)腺苷3´,5´-單磷酸（cAMP）信號(hào)通路；通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)β-arrestin（一種細(xì)胞質(zhì)蛋白）報(bào)告細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞表面抗體展示文庫。針對(duì)β1腎上腺素受體激動(dòng)劑，需檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，采用酶互補(bǔ)法檢測(cè)β-arrestin通路活性。利用cAMP水平變化評(píng)價(jià)大麻素受體1（CB1）激動(dòng)劑抗體的效價(jià)?？咕徏る腂2受體（BKB2R）單克隆抗體的活性通過抗體誘導(dǎo)細(xì)胞中糖原合成酶激酶3（GSK-3）磷酸化進(jìn)行評(píng)估?，F(xiàn)有技術(shù)和理論進(jìn)步已經(jīng)使膜蛋白治療性抗體在研發(fā)、純化、篩選和改造方面有了長足的進(jìn)步，相信在不久的將來會(huì)有更多靶向膜蛋白藥物被用于疾病預(yù)防與臨床治療。