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強(qiáng)制降解試驗(yàn)的目的

 

強(qiáng)制降解目的識(shí)別可能的降解產(chǎn)物，建立降解途徑，明確分子的化學(xué)穩(wěn)定性，并驗(yàn)證分析方法的專屬性。

小編  了解降解途徑，能把降解雜質(zhì)結(jié)構(gòu)研究出來(lái)最好。

 

強(qiáng)制降解試驗(yàn)的開(kāi)展時(shí)間

 

文獻(xiàn)中重點(diǎn)提及新藥研究，F(xiàn)DA建議在Phase III階段進(jìn)行降解試驗(yàn)。對(duì)于API，應(yīng)進(jìn)行不同pH溶液、氧氣和光照、高溫高濕條件下的降解試驗(yàn)。采用一批樣品進(jìn)行，結(jié)果在年報(bào)中進(jìn)行提交。

小編 對(duì)于仿制藥研發(fā)，一般在工藝優(yōu)化完成后、分析方法驗(yàn)證過(guò)程中，由分析人員開(kāi)展。為了有更多的時(shí)間研究強(qiáng)制降解雜質(zhì)，在工藝研發(fā)期間，合成人員就應(yīng)該提前介入強(qiáng)制降解的研究，酸破壞、堿破壞、氧化破壞等。分析驗(yàn)證期間，分析人員更多的是執(zhí)行一些有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)。也許有些企業(yè)是這么做的。

 

降解的程度

 

降解多少才合適這個(gè)問(wèn)題，一直有爭(zhēng)議，一般認(rèn)為降解5%-20%，對(duì)于分析方法含量驗(yàn)證是可以接受的。

有些科學(xué)家認(rèn)為10%的降解程度是最佳的。其他科學(xué)家建議可在API中加入已知降解雜質(zhì)，去考察監(jiān)控藥品穩(wěn)定性的方法。

 

沒(méi)必要要求強(qiáng)制降解試驗(yàn)一定要產(chǎn)生降解產(chǎn)物。如果在加速穩(wěn)定性方案中的降解條件下，原料藥和藥品沒(méi)有降解，那么降解研究可以終止。

過(guò)度降解可能導(dǎo)致二級(jí)降解產(chǎn)物，失去降解研究的意義。而這在產(chǎn)品的儲(chǔ)存期間可能并不會(huì)產(chǎn)生。推薦在溶液中進(jìn)行最長(zhǎng)為14d的降解試驗(yàn)（氧化降解試驗(yàn)最長(zhǎng)24h），為分析方法開(kāi)發(fā)提供降解樣品。

 

降解條件設(shè)計(jì)方案

 

對(duì)于原料藥和藥品，通常的降解方案如下流程圖所示：

 

 

降解條件最少應(yīng)包括酸堿水解、熱、氧化、光照，還可能有凍融循環(huán)等。指導(dǎo)原則中沒(méi)有pH、溫度、氧化劑的特別規(guī)定。光降解試驗(yàn)根據(jù)ICHQ1B中要求的光源進(jìn)行。最初目標(biāo)是找到使原料藥產(chǎn)生大約10%降解的條件。

 

降解試驗(yàn)中最常用的降解條件見(jiàn)表1。

 

 

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，開(kāi)始時(shí)使用80℃條件或更高溫度條件，可以通過(guò)短時(shí)間（2，5，8，24h等）內(nèi)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)試評(píng)估降解速率。主要降解雜質(zhì)和次級(jí)降解雜質(zhì)會(huì)通過(guò)早期時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)進(jìn)行區(qū)分，有助于更好的理解降解途徑。

還有一種方法是按表1中的條件開(kāi)始降解，然后根據(jù)情況增加或減弱條件來(lái)獲得足夠的降解。這種降解策略較好，理由如下：

使用劇烈條件時(shí)降解路徑可能發(fā)生改變；

 

當(dāng)使用高濃度反應(yīng)試劑，如酸、堿等，在進(jìn)行HPLC 分析時(shí)，樣品需要中和或稀釋。

 

樣品濃度的選擇

 

降解試驗(yàn)中采用何種濃度？

 

目前指導(dǎo)原則中沒(méi)有規(guī)定。文獻(xiàn)研究者推薦采用1mg/ml作為起始研究濃度，通?？梢垣@得很小的降解雜質(zhì)。有些降解研究建議在最終處方濃度下進(jìn)行。

 

降解條件分析

 

水解降解

水解降解一般在較寬pH范圍內(nèi)進(jìn)行，包括化合物與水的反應(yīng)。

酸堿降解包括原料藥與酸或堿接觸后產(chǎn)生主要降解雜質(zhì)。

酸或堿的種類(lèi)和濃度的選擇取決于藥物的穩(wěn)定性。一般選擇鹽酸或硫酸(0.1-1M)為酸水解和氫氧化鈉或氫氧化鉀(0.1-1M)作為堿水解的條件。

如果化合物難溶于水，可加入其他助溶劑使其在鹽酸或氫氧化鈉溶液中溶解。助溶劑的選擇應(yīng)基于藥物的結(jié)構(gòu)。

降解試驗(yàn)一般從室溫開(kāi)始，如果沒(méi)有降解，則提高溫度為50-70℃。降解不應(yīng)超過(guò)7天。降解樣品用適當(dāng)?shù)乃帷A或緩沖液中和，以避免進(jìn)一步發(fā)生降解。

氧化降解

過(guò)氧化氫廣泛用于原料藥的氧化降解研究。其他氧化劑，例如：氧氣和自由基引發(fā)劑（AIBN，偶氮二異丁腈）也可以使用。氧化劑的種類(lèi)、濃度、氧化條件的選擇取決于藥物本身。

文獻(xiàn)報(bào)道樣品采用0.1-3%過(guò)氧化氫溶液在中性pH條件、室溫下放置7天或者達(dá)到20%的降解時(shí)，可能會(huì)生產(chǎn)相關(guān)的降解雜質(zhì)。胺、硫化物和苯酚易受電子轉(zhuǎn)移氧化產(chǎn)生N -氧化物、羥胺、砜和亞砜。不穩(wěn)定氫如芐基碳、烯丙基碳、和叔碳或α-位氫原子容易氧化形成氫過(guò)氧化物、羥基或酮。

光降解

藥物的光降解試驗(yàn)應(yīng)證明對(duì)光不會(huì)發(fā)生變化。光降解試驗(yàn)應(yīng)將藥物置于UV或熒光條件下產(chǎn)生主要降解雜質(zhì)。推薦條件見(jiàn)ICH指導(dǎo)原則。

原料或固體/液體制劑應(yīng)采用1.2 million lx h和200Wh/m2的光進(jìn)行研究。通常采用300-800nm波長(zhǎng)進(jìn)行光降解。最大光照強(qiáng)度為6 million lx h。

光降解可通過(guò)自由基機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生光氧化。

熱降解

熱降解(例如：干熱和濕熱)應(yīng)該在比ICH Q1A規(guī)定的加速條件更劇烈的情況下進(jìn)行。

固態(tài)的原料藥和藥品樣品應(yīng)該在干熱和濕熱的條件下進(jìn)行研究；而液體制劑應(yīng)在干熱條件下進(jìn)行研究。

研究應(yīng)該在較高溫度較短時(shí)間下進(jìn)行，一般選擇40℃-80℃條件下進(jìn)行。

 

穩(wěn)定性指示方法

 

穩(wěn)定性指示方法（SIM）是用來(lái)對(duì)制劑中API的降解進(jìn)行定量測(cè)定的方法。

在FDA指導(dǎo)原則中，SIM是一個(gè)定量分析方法，可以用來(lái)檢測(cè)藥物和制劑隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性情況。SIM在檢測(cè)API時(shí)，不應(yīng)受到降解產(chǎn)物、雜質(zhì)和輔料的干擾。降解試驗(yàn)是用來(lái)研究SIM方法的專屬性的。開(kāi)發(fā)一個(gè)SIM可以用于處方前研究、穩(wěn)定性研究、貯藏條件開(kāi)發(fā)。

以下是采用HPLC開(kāi)發(fā)滿足法規(guī)要求的SIM方法的步驟。

樣品

開(kāi)發(fā)SIM方法時(shí)，原料藥的降解條件應(yīng)比加速試驗(yàn)劇烈，包括水解、氧化、光照、熱條件。API進(jìn)行固體和液體條件下的降解是為了真實(shí)貯藏條件下可能產(chǎn)生的降解雜質(zhì)。

方法開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

在方法開(kāi)發(fā)前，應(yīng)了解藥物的理化性質(zhì)，如pKa、logP、溶解度等，為HPLC方法的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。logP和溶解度有助于選擇流動(dòng)相和溶劑，而pKa有助于確定流動(dòng)相的pH值。

降解樣品組分的分離首選反相色譜柱，不同比例的甲醇、水、乙腈可以作為初始條件進(jìn)行分離研究。選擇甲醇還是乙腈，應(yīng)基于分析物的溶解度。開(kāi)始時(shí)水-有機(jī)相比例可以為50：50，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)獲得好的分離度。為獲得更好的分離度與峰對(duì)稱性可加入緩沖液。

色譜柱溫度的變化可影響方法的選擇，30-40℃的柱溫適合產(chǎn)生好的分離重現(xiàn)性。藥物色譜峰在色譜圖中保留時(shí)間最好晚一點(diǎn)，使所有的降解產(chǎn)物能被分離，同時(shí)藥物峰出現(xiàn)后，也應(yīng)運(yùn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間，保證藥物色譜峰后的降解雜質(zhì)能夠充分洗脫出來(lái)。

分析方法開(kāi)發(fā)過(guò)程，有時(shí)藥物色譜峰中包著一個(gè)雜質(zhì)峰或降解雜質(zhì)峰，與藥物一起洗脫下來(lái)。這時(shí)需要用峰純度的檢測(cè)來(lái)確定方法的專屬性。

直接方法包括改變色譜條件中的流動(dòng)相比例、色譜柱等，來(lái)改善分離。調(diào)整色譜條件后再進(jìn)行光譜比較。

 

如果降解產(chǎn)物在加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)中不產(chǎn)生是可以接受的。方法可以通過(guò)調(diào)節(jié)流速、進(jìn)樣體積、色譜柱類(lèi)型、流動(dòng)相比例進(jìn)行鄰近色譜峰的優(yōu)化。

 

方法驗(yàn)證

根據(jù)USP/ICH指導(dǎo)原則進(jìn)行線性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、檢測(cè)限、耐用性和耐受性的驗(yàn)證。應(yīng)該能夠分離、識(shí)別、定量鑒定限（通常為0.1%）以上的雜質(zhì)。如果方法驗(yàn)證不符合要求，應(yīng)進(jìn)行調(diào)整和重新驗(yàn)證。

文獻(xiàn)中還提到了其他分析方法，感興趣的可以查閱源文獻(xiàn)。

 

參考文獻(xiàn)

 

Journal of Pharmaceutical Analysis 2014;4(3):159–165