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本文主要介紹了杭州可幫基因科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

 

一、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的產(chǎn)品主要組成成分

 

試劑盒由以下組分組成，主要組成成分見表 1。 

 

表 1 試劑盒主要組成成分

 

二、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的產(chǎn)品預(yù)期用途

 

本產(chǎn)品適用于定性檢測(cè)組織分化程度較差或疑似轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤患者的福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中 90 個(gè)組織特異基因表達(dá)模式（Gene Expression Pattern），用于判別腫瘤組織起源，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌和尿路上皮癌。

本產(chǎn)品與《腫瘤組織起源基因分析軟件》配合使用，不用于區(qū)分原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移性腫瘤。在惡性腫瘤病理檢查過程中，對(duì)于不能排除為轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，本產(chǎn)品可為病理醫(yī)生診斷腫瘤的類型和組織起源提供支持；但在確定腫瘤分期、評(píng)估預(yù)后和指導(dǎo)治療等方面，本產(chǎn)品不能替代免疫組化。同時(shí)，本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不能作為癌癥診斷的唯一依據(jù)。病理醫(yī)生還應(yīng)參考病史信息、影像學(xué)檢查和其他病理檢查結(jié)果，對(duì)受檢標(biāo)本的腫瘤類型和組織起源進(jìn)行綜合判斷，出具診斷報(bào)告。本產(chǎn)品不適用于淋巴瘤和經(jīng)脫鈣處理的骨腫瘤樣本。

病理診斷是當(dāng)前腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而免疫組化檢測(cè)則是病理診斷中對(duì)腫瘤進(jìn)行分型的基礎(chǔ)，對(duì)于腫瘤分化程度較差（HE切片上缺少腫瘤細(xì)胞起源的特征）或者疑似轉(zhuǎn)移性腫瘤尤為重要。腫瘤的分型通常需要聯(lián)合數(shù)個(gè)免疫組化抗體，分步驟地進(jìn)行檢測(cè)，病理醫(yī)生往往只能選取數(shù)量有限的免疫組化抗體進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化用于腫瘤診斷所面臨的挑戰(zhàn)還包括，對(duì)于部分腫瘤無(wú)法找到特異性的免疫組化抗體。當(dāng)缺乏特異性的免疫組化標(biāo)記或少數(shù)非特異性免疫組化標(biāo)記為陽(yáng)性時(shí)，病理診斷往往只能給出較為模糊的診斷結(jié)果。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)移性腫瘤的基因表達(dá)譜與轉(zhuǎn)移部位組織的基因表達(dá)譜存在差異，而與其原發(fā)部位組織的基因表達(dá)譜更相似，提示腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的過程中，始終保留其組織起源的分子特征。因此，基因表達(dá)譜檢測(cè)可在分子水平揭示腫瘤的組織起源，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的分型。

 

三、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的產(chǎn)品包裝規(guī)格

 

10 測(cè)試/盒

 

四、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

 

該產(chǎn)品基于實(shí)時(shí)熒光 PCR 平臺(tái)，檢測(cè)腫瘤樣本 RNA 中組織特異基因的表達(dá)模式，并與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中已知腫瘤類型的基因表達(dá)模式進(jìn)行比對(duì)，判斷待測(cè)腫瘤樣本組織起源。該產(chǎn)品利用特異引物對(duì) 90 個(gè)組織特異基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并通過 TaqMan-MGB 探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上獲取樣本組織特異基因的表達(dá)模式。采用《腫瘤組織起源基因分析軟件》對(duì)待測(cè)樣本的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，軟件可自動(dòng)比較待測(cè)樣本與已知組織起源的腫瘤基因表達(dá)模式之間的相關(guān)性，從而判斷待測(cè)腫瘤樣本的組織起源。《腫瘤組織起源基因分析軟件》參考數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋根據(jù)組織細(xì)胞起源和解剖學(xué)部位定義的 14 種腫瘤類型，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌及尿路上皮癌。該產(chǎn)品選用人源管家基因作為內(nèi)部參照（以下簡(jiǎn)稱內(nèi)參）系統(tǒng)，對(duì)樣本 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)過程進(jìn)行質(zhì)量控制。

 

五、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的主要原材料

 

1.主要原材料的選擇

該產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、dNTPs、DNA 聚合酶、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶及對(duì)照品等。原材料均通過外購(gòu)的方式獲得?？蓭突?qū)χ饕牧线M(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況

該產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和重復(fù)性參考品。質(zhì)控品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。企業(yè)參考品的主要原材料為臨床組織樣本。陽(yáng)性參考品包括28 種，分別為該產(chǎn)品涵蓋的 14 種腫瘤類型的 FFPE 腫瘤組織樣本。陰性參考品包括 8 種，分別為該產(chǎn)品不涵蓋的 5 種腫瘤類型的 FFPE 腫瘤組織樣本，以及 3 種 FFPE 正常組織樣本。檢測(cè)限參考品包括 15 種，分別為 14 種腫瘤類型最低檢測(cè)限參考品，由陽(yáng)性參考品的 RNA 稀釋而成；以及 1 種基因表達(dá)最低檢測(cè)限參考品，涵蓋該產(chǎn)品所有檢測(cè)基因。重復(fù)性參考品包括 2 種，分別為涵蓋該產(chǎn)品所有檢測(cè)基因的強(qiáng)陽(yáng)性重復(fù)性參考品和弱陽(yáng)性重復(fù)性參考品?；虮磉_(dá)最低檢測(cè)限參考品和重復(fù)性參考品均由臨床腫瘤組織 RNA 樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，采用數(shù)字 PCR 方法測(cè)定拷貝數(shù)后進(jìn)行稀釋而成。

該試劑盒同時(shí)設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，用于檢測(cè)過程中試劑和儀器的質(zhì)量控制。此外，每個(gè)樣本均檢測(cè)內(nèi)參基因，用于結(jié)果的判讀及評(píng)估樣本的質(zhì)量。

 

六、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

 

可幫基因?qū)υ噭┖蟹磻?yīng)體系的研究包括引物探針濃度的確定、PCR 擴(kuò)增預(yù)混試劑用量的確定、dNTPs 濃度的確定、隨機(jī)引物濃度的確定、逆轉(zhuǎn)錄酶濃度的確定等；對(duì) PCR 反應(yīng)條件的研究包括 PCR 反應(yīng)程序的優(yōu)化、基線閾值和閾值循環(huán)數(shù)的確定；對(duì)樣本采集要求、樣本保存時(shí)間、樣本核酸提取方法和樣本用量進(jìn)行了研究。對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的全部癌種分別進(jìn)行樣本 RNA 的提取及濃度、純度的研究，確定提取后 RNA 濃度應(yīng)≥60ng/μL 且其A260/A280 應(yīng)在 1.7～2.1。通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系?？蓭突蚋鶕?jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。

 

七、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的分析性能評(píng)估

 

該產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括樣本穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、分析特異性、最低檢測(cè)限、精密度、包容性、干擾物質(zhì)研究。

1.樣本穩(wěn)定性研究

可幫基因?qū)υ摦a(chǎn)品適用的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）病理組織切片保存穩(wěn)定性、對(duì)提取后的 RNA 樣本保存條件和凍融穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。確定該產(chǎn)品可以檢測(cè)保存時(shí)間不超過 3 年 的 FFPE 樣本；提取后的 RNA 樣本在-70℃~-80℃保存不超過 6個(gè)月，凍融次數(shù)不超過 3 次。

2.準(zhǔn)確度研究

可幫基因檢測(cè) 28 份企業(yè)陽(yáng)性參考品，檢測(cè)結(jié)果分別為對(duì)應(yīng)的腫瘤類型，陽(yáng)性符合率 100%；檢測(cè) 8 份企業(yè)陰性參考品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率 100%；檢測(cè) 90 份病理診斷結(jié)果明確的低分化或未分化腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤臨床樣本，準(zhǔn)確性為 100%。

3.分析特異性

分析特異性研究包括組織起源鑒別能力研究和交叉反應(yīng)研究?？蓭突蜻x擇產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的全部癌種的轉(zhuǎn)移性腫瘤樣本，使用三個(gè)批次的試劑盒對(duì)該產(chǎn)品的組織起源鑒別能力進(jìn)行研究，檢測(cè)結(jié)果顯示能準(zhǔn)確鑒別腫瘤組織及其配對(duì)癌旁組織樣本的不同組織起源。可幫基因選擇產(chǎn)品檢測(cè)范圍外的 8 種腫瘤組織或正常組織樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)研究，包括淋巴瘤、陰莖癌、骨髓瘤、胸腺癌、皮膚鱗癌、淋巴結(jié)組織、扁桃體組織、皮膚組織，結(jié)果均為陰性。

4.最低檢測(cè)限研究

最低檢測(cè)限研究包括各個(gè)靶基因最低檢測(cè)限的研究和可檢測(cè)腫瘤組織最低比例的研究。

可幫基因使用三個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)產(chǎn)品 90 個(gè)靶基因的最低檢測(cè)限進(jìn)行研究，確定試劑盒對(duì)于每個(gè)靶基因最低檢測(cè)限，結(jié)果顯示各個(gè)靶基因的最低檢測(cè)限為 5 拷貝/μL 至 50 拷貝/μL。

可幫基因使用三個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的全部癌種進(jìn)行研究。對(duì)每種腫瘤類型的不同腫瘤細(xì)胞比例的樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定可檢測(cè)腫瘤組織的最低比例為腫瘤細(xì)胞比例 60%。

5.精密度

精密度研究采用三個(gè)不同批次的試劑盒，通過不同地點(diǎn)、人員、輪次、日間和批次對(duì)不同癌種的腫瘤臨床樣本進(jìn)行連續(xù) 20天精密度研究，檢測(cè)結(jié)果（相似度分?jǐn)?shù)最大值）變異系數(shù) CV 均不高于 15%。

對(duì)連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用企業(yè)強(qiáng)陽(yáng)性重復(fù)性參考品和弱陽(yáng)性重復(fù)性參考品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，每批試劑盒每份參考品重復(fù)檢測(cè) 10 次，每個(gè)靶基因的 Ct 值變異系數(shù) CV 均不高于 5%。

6.包容性研究

可幫基因采用三個(gè)不同批次的試劑盒對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的各腫瘤類型及相關(guān)亞型進(jìn)行包容性確認(rèn)，結(jié)果表明試劑盒對(duì)各腫瘤類型及其相關(guān)亞型均能正確檢出，試劑盒包容性良好。

7.干擾物質(zhì)研究

干擾物質(zhì)研究分為外源性干擾物質(zhì)研究和內(nèi)源性干擾物質(zhì)研究。

外源性干擾物研究包括針對(duì) FFPE 樣本在處理過程中的常見的酒精、福爾馬林和石蠟的干擾試驗(yàn)研究。研究結(jié)果表明，當(dāng)酒精≤1%（V/V）、福爾馬林≤0.005%（V/V）、石蠟≤1%（V/V）

時(shí)，對(duì)該產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生干擾。

內(nèi)源性干擾物研究包括針對(duì)癌旁組織和壞死組織的干擾試驗(yàn)研究。研究結(jié)果表明，當(dāng)待測(cè)樣本中癌旁組織或壞死組織比例≤40%時(shí)，對(duì)該產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生影響。

 

八、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的陽(yáng)性判斷值研究

 

該產(chǎn)品陽(yáng)性判斷值的研究采用診斷信息明確的 600 例臨床腫瘤樣本，涵蓋全部腫瘤類型。對(duì) 600 例腫瘤臨床樣本的最大相似度分?jǐn)?shù)采用最優(yōu)離散化算法確定試劑盒的相似度分?jǐn)?shù)陽(yáng)性判斷值為 45.3。結(jié)果顯示當(dāng)相似度分?jǐn)?shù)＜45.3 時(shí)，樣本的檢測(cè)結(jié)果為陰性；當(dāng)相似度分?jǐn)?shù)≥45.3 時(shí)，樣本的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。當(dāng)以最大相似度分?jǐn)?shù)45.3作為陽(yáng)性判斷值，對(duì)診斷明確的臨床腫瘤樣本的組織起源或類型進(jìn)行判定時(shí)，各腫瘤類型的陽(yáng)性符合率和陰性符合率，結(jié)果如下：

 

九、腫瘤組織起源基因檢測(cè)試劑盒 （PCR熒光探針法）的穩(wěn)定性研究

 

可幫基因?qū)υ摦a(chǎn)品的穩(wěn)定性研究包括貨架效期穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性（包括開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性）。貨架有效期穩(wěn)定性：將三批次試劑盒置于-15℃~-25℃保存，分別于不同時(shí)間點(diǎn)使用企業(yè)參考品對(duì)試劑盒的性能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明試劑盒在-15℃~-25℃保存條件下，產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月。此外，可幫基因?qū)Ξa(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說明書的聲稱。