您當(dāng)前的位置：檢測(cè)資訊 > 科研開發(fā)
嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-08-25 00:11
關(guān)鍵詞
3D類器官，類器官血管化，腫瘤和免疫環(huán)境的相互作用，類器官系統(tǒng)構(gòu)建，疾病模型，新藥篩選，藥物毒理，干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)
提到類器官，許多研究人員腦海中浮現(xiàn)的關(guān)鍵詞便是：前沿、高級(jí)、好發(fā)文章等。
作為當(dāng)下最為火熱的研究方向之一，類器官為廣大研究人員在體外真實(shí)模擬體內(nèi)器官發(fā)育、疾病機(jī)制研究、靶點(diǎn)藥物開發(fā)提供了便利。其具有的諸多優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被各類文章相繼報(bào)道。
盡管近10年來(lái)類器官研究如火如荼，各種類器官相繼被開發(fā)出來(lái)。但是，缺乏血管化結(jié)構(gòu)、缺乏免疫細(xì)胞、器官系統(tǒng)化程度低等問題限制了類器官研究的進(jìn)一步發(fā)展。
今天，我們就從最新的研究文獻(xiàn)入手，逐步破局類器官研究的“三大挑戰(zhàn)”。
血管化
在所有的類器官研究中，腦類器官應(yīng)該是最為特殊的，不僅因?yàn)槠渑R床樣本的珍貴性，還得益于其重要的臨床價(jià)值。然而，長(zhǎng)久以來(lái)，腦類器官的發(fā)展并不順利，這其中最主要的障礙在于腦類器官系統(tǒng)缺乏體內(nèi)腦組織的微環(huán)境、神經(jīng)元回路、血管和免疫系統(tǒng)。
尤其是血管，其對(duì)于腦組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞分化都發(fā)揮著促進(jìn)作用。血管的缺乏導(dǎo)致腦類器官中心壞死，進(jìn)一步干擾其正常發(fā)育和神經(jīng)元遷移路線。盡管與血管干細(xì)胞的共培養(yǎng)為上述問題提供了一定解決方案，但營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和真實(shí)血液微環(huán)境的問題仍然存在。
2019年，來(lái)自耶魯大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂刊Nature Methods在線發(fā)表了題為《Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system》的研究性論文。文中使用表達(dá)人類 ETS 變體 2 ( ETV2 )的人類胚胎干細(xì)胞 (hESCs)成功構(gòu)建了具有血管樣結(jié)構(gòu)的腦皮質(zhì)類器官(hCOs)，該類器官具有類血腦屏障結(jié)構(gòu)，包括緊密連接、營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和跨內(nèi)皮電阻的表達(dá)增加，填補(bǔ)了腦類器官缺失血管的問題，豐富了腦類器官的研究應(yīng)用。
ETV2轉(zhuǎn)錄因子是機(jī)體發(fā)育時(shí)期內(nèi)皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因。在這項(xiàng)研究中， 研究人員使用含有賽默飛Gibco B-27添加劑的培養(yǎng)基中，添加ETV2誘導(dǎo)產(chǎn)生了腦皮質(zhì)類器官 (hCOs)，并通過(guò)改變了ETV2的比例（5%、10% 和 20%）和誘導(dǎo)時(shí)間，確定了在 hCOs 中形成血管樣結(jié)構(gòu)的最佳條件：20% ETV2，18天誘導(dǎo)。通過(guò)免疫熒光，研究人員在該條件下可以顯著觀察到hCOs高表達(dá)的EC 標(biāo)記CDH5、CD31、KDR、TEK、vWF和CD34。同時(shí)研究人員將具有血管樣結(jié)構(gòu)的 hCOs 命名為 vhCO。
Fig.1 Characterization of vasculature-like structures in vhCOs.
為了評(píng)估vhCO的血管樣結(jié)構(gòu)是否具有相應(yīng)的功能，研究人員又分別在30、70 和 120 天評(píng)估了心室 (VZ) 樣區(qū)、心室下 (SVZ) 樣區(qū)和皮質(zhì)層的分化情況。免疫熒光結(jié)果顯示hCOs 和 vhCOs 在管腔周圍都表現(xiàn)出高表達(dá) SOX2的VZ 和 TBR1的SVZ。這些結(jié)果表明 hCOs 和 vhCOs 分化程度相似，都具有大腦皮層結(jié)構(gòu)的區(qū)域和形態(tài)特征。
同時(shí)，使用CD31分子的整體免疫熒光染色，研究人員對(duì)內(nèi)皮和血管樣網(wǎng)絡(luò)的組織也進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30天時(shí)，vhCOs具有血管樣結(jié)構(gòu)，而hCOs則沒有。在70天時(shí)， vhCOs中形成更加復(fù)雜的血管樣結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果表明了ETV2可以成功誘導(dǎo)的血管樣結(jié)構(gòu)類器官的產(chǎn)生。
Fig.2 vhCOs demonstrate BBB characteristics.
結(jié)構(gòu)和功能是相輔相成的兩個(gè)有機(jī)組成。在分析了vhCOs中血管樣結(jié)構(gòu)的形成后，研究人員又對(duì)其功能進(jìn)行了評(píng)估。
首先通過(guò)灌注FITC-葡聚糖，研究人員確定了vhCOs中血管具有可灌注的功能。其次，通過(guò)對(duì)hCOs 和 vhCOs生長(zhǎng)情況的對(duì)比，研究人員發(fā)現(xiàn)vhCOs中血管具有運(yùn)送氧氣的功能。最后，通過(guò)對(duì)分化神經(jīng)元的分析，研究人員確定了表明 vhCOs中的血管樣結(jié)構(gòu)對(duì)于神經(jīng)元成熟起著關(guān)鍵作用。
Fig.3 Single-cell analysis of vhCOs.
進(jìn)一步地，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序，研究人證明了ETV2對(duì) vhCO 中的血管 EC成熟和血管形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要。同時(shí)，與發(fā)育中的人類大腦 (GW08-23) 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜進(jìn)行比較后，研究人員證明了vhCOs 衍生的神經(jīng)元類對(duì)應(yīng)妊娠期16-19 周的神經(jīng)元發(fā)育，進(jìn)一步證明其向內(nèi)皮譜系分化的潛力。
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子ETV2與腦類器官，首次構(gòu)建了具有血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及類血腦屏障結(jié)構(gòu)的腦類器官，為解決腦類器官乃至其他類器官培養(yǎng)過(guò)程中缺失血管這一關(guān)鍵問題提供了對(duì)策，推動(dòng)了類器官研究的發(fā)展。
免疫化
免疫治療的興起極大推動(dòng)了腫瘤研究的發(fā)展，然而由于種屬特異性、人源化體系的復(fù)雜性、免疫系統(tǒng)的部分或無(wú)效重組建等問題，致使免疫腫瘤模型面臨著巨大的挑戰(zhàn)，臨床上迫切需要能夠用于個(gè)體化驗(yàn)證療效的體外模型。類器官的出現(xiàn)給腫瘤免疫治療提供了新的契機(jī)，然而，現(xiàn)有的類器官中缺乏免疫細(xì)胞限制了其發(fā)展。
一項(xiàng)發(fā)表于頂刊Cell題為《Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids》的研究性論文為這個(gè)問題的解決提供了新的策略。
Fig.4 Co-culture of epithelial tumor organoids and peripheral blood lymphocytes
在這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)來(lái)自患者的自體腫瘤類器官和外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)建立一個(gè)能夠特異性誘導(dǎo)分析腫瘤免疫反應(yīng)的平臺(tái)，為分離評(píng)估腫瘤免疫中T細(xì)胞提供了新的方法。
Fig.5 Characterization of a Panel of dMMR CRC Organoids
首先，研究人員從13 名錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷型(dMMR)結(jié)直腸癌患者（dMMR CRC）體內(nèi)分離15 個(gè)腫瘤類器官，成功率為60%，并使用含有賽默飛Gibco B-27添加劑的培養(yǎng)基按照1:2 至 1:5進(jìn)行傳代培養(yǎng)。隨后，研究人員對(duì)著15個(gè)腫瘤類器官的特點(diǎn)進(jìn)行了分析。通過(guò)全外顯子組測(cè)序 (WES)、免疫組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)MHC-1類分子的缺失不是類器官的一般特征。
Fig.6 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells by Co-culture with Autologous Tumor Organoids
進(jìn)一步地，為了評(píng)估該腫瘤類器官是否可用于獲得腫瘤特異性 T 細(xì)胞。研究人員構(gòu)建了“腫瘤類器官-外周血淋巴細(xì)胞”共培養(yǎng)模型。其中，外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) 從 dMMR CRC 患者中分離出來(lái)，并每周使用自體腫瘤類器官刺激。通過(guò)對(duì)CD8+ T 細(xì)胞效應(yīng)分子 IFNγ 和CD107a進(jìn)行染色分析，在共培養(yǎng) 2 周后評(píng)估CD8 + T 細(xì)胞對(duì)腫瘤的識(shí)別情況。
結(jié)果表明在 8個(gè)MHC-1 陽(yáng)性腫瘤類器官中，有 4 個(gè)（50%）在共培養(yǎng) 2 周后，IFNγ 和CD107a發(fā)生了上調(diào)。而在MHC I 類缺陷類器官中沒有發(fā)生上調(diào)，并且與類器官刺激前相比，CD8+ T 細(xì)胞群增加了10倍。這些結(jié)果表明了該系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生評(píng)估腫瘤特異性 T細(xì)胞亞群。
Fig.7 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells from Patients with NSCLC
進(jìn)一步地，研究人員又使用非小細(xì)胞肺癌對(duì)該系統(tǒng)的廣譜性進(jìn)行了分析。通過(guò)前述類似的方法，研究人員在培養(yǎng)兩周后也觀察到了CD8+ T 細(xì)胞群進(jìn)行了擴(kuò)大。
綜上，這些結(jié)果表明：通過(guò)腫瘤類器官與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)可以有效誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。這一研究也極大拓展了類器官在腫瘤免疫中的應(yīng)用，為解決類器官免疫細(xì)胞缺失問題提供了新的策略。
系統(tǒng)化
許多疾病的發(fā)生都是多器官系統(tǒng)共同作用完成的，而傳統(tǒng)的單個(gè)類器官雖然能夠較為真實(shí)的模擬體內(nèi)單個(gè)器官的環(huán)境，但是對(duì)于多系統(tǒng)發(fā)生的疾病，仍然存在一定的缺陷。因此，構(gòu)建多系統(tǒng)協(xié)同作用的類器官就成為解決這個(gè)問題的一個(gè)研究方向。
2021年11月，一項(xiàng)發(fā)表于著名期刊ADVANCED SCIENCE的研究《Microengineered Multi-Organoid System from hiPSCs to Recapitulate Human Liver-Islet Axis in Normal and Type 2 Diabetes》中，就通過(guò)構(gòu)建肝臟和胰島類器官共培養(yǎng)構(gòu)建了2型糖尿病（T2DM）疾病模型，這種多類器官系統(tǒng)可以在生理和病理?xiàng)l件下體外模擬肝胰島軸，為今后 T2DM 發(fā)病機(jī)制研究和藥物開發(fā)提供了獨(dú)特的研究平臺(tái)。
Fig.8 Schematic of hiPSCs derived multi-organoid-on-chip system to model human liver-pancreatic islet axis in vitro.
2型糖尿?。═2DM）的發(fā)病率逐年攀升，并且治療費(fèi)用昂貴，極大加重了社會(huì)的疾病負(fù)擔(dān)。T2DM 的特點(diǎn)是高血糖和胰島素抵抗，通常伴有胰腺β細(xì)胞功能障礙和肝臟中的胰島素抵抗。肝臟和胰島在維持血糖正常方面表現(xiàn)出雙重功能，兩者的功能紊亂導(dǎo)致了T2DM的發(fā)生。
目前研究葡萄糖代謝和 T2DM依賴于動(dòng)物模型，或使用原代動(dòng)物肝細(xì)胞和胰島β細(xì)胞或其細(xì)胞系的混合物。但是，這些模型不能準(zhǔn)確模擬人類生理功能和代謝反應(yīng)，尤其各個(gè)不同器官間的相互作用。類器官的出現(xiàn)給解決上述問題帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)。
在這項(xiàng)研究中，研究人員開發(fā)了一種微流控多類器官系統(tǒng)，用于研究人類肝胰島軸在正常和疾病環(huán)境中的胰島素和葡萄糖調(diào)節(jié)。
為了模擬體內(nèi)肝臟和胰島之間的葡萄糖調(diào)節(jié)，研究人員構(gòu)建了一套微流控控制的多類器官系統(tǒng)，包括類器官共培養(yǎng)芯片、蠕動(dòng)泵和灌注裝置。微流控芯片由平行微通道網(wǎng)絡(luò)連接的兩個(gè)隔室組成。每個(gè)隔室都包含一系列微孔，以維持肝臟和胰島類器官的 3D 培養(yǎng)。相互連接的微通道促進(jìn)了兩種類器官之間的介質(zhì)交換和分泌代謝產(chǎn)物，由此實(shí)現(xiàn)了肝臟和胰島類器官的共培養(yǎng)。
其中，肝臟和胰島類器官是通過(guò)微孔陣列中 hiPSCs 的產(chǎn)生的，并使用含有賽默飛Gibco B-27添加劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，最終在微孔中形成了具有均勻尺寸和形態(tài)（直徑 200 µm）的擬胚體 (EB)。
此外，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加特定的生長(zhǎng)因子和小分子，EB 分化為內(nèi)胚層細(xì)胞，并分別在第 20 天和第 23 天分化為肝臟或胰腺譜系。隨后，將肝臟和胰島類器官轉(zhuǎn)移到芯片裝置中進(jìn)行長(zhǎng)期共培養(yǎng)。
Fig.9 Identification of organ-specific protein and gene expressions in liver and islet organoids prior to co-culture assay.
在共培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建完成后，研究人員在第 0、5、11、20 和 23 天分別觀察肝臟和胰島類器官的形態(tài)和大小分布。結(jié)果表明在培養(yǎng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中，肝臟和胰島類器官的平均大小逐漸增加，形態(tài)保持良好。此外，通過(guò)活流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力后發(fā)現(xiàn)99.03%的肝臟類器官和96.11%的胰島類器官細(xì)胞保持了良好的細(xì)胞活力。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證該共培養(yǎng)類器官的功能，研究人員在第 20 天使用免疫熒光和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) 鑒定了肝臟特異性細(xì)胞類型和蛋白質(zhì)分泌。結(jié)果表明，hiPSC 誘導(dǎo)分化的肝類器官具有代謝藥物的能力并含有天然肝臟的關(guān)鍵細(xì)胞成分。同樣，通過(guò)免疫組織化學(xué)分析和 RT-PCR 證實(shí)了 hiPSC 誘導(dǎo)分化的胰島類器官是含有四種類型 ECs 的典型多細(xì)胞組織。
Fig.10 Comparison of cell viability and functionality of liver and islet organoids under mono- and co-culture conditions.
同時(shí)，研究人員又對(duì)該共培養(yǎng)類器官系統(tǒng)進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)30天的功能研究。與單獨(dú)的類器官培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)中類器官在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出了更高的細(xì)胞活力，并顯著提高了胰島類器官的存活率和胰島素分泌功能。
綜上，這項(xiàng)研究構(gòu)建的多類器官芯片系統(tǒng)為研究多器官疾病發(fā)生提供了新的研究策略，并填補(bǔ)了單個(gè)類器官無(wú)法模擬多系統(tǒng)相互作用的空白。同時(shí)，這項(xiàng)研究也讓我們看到了結(jié)合不同的技術(shù)手段豐富類器官培養(yǎng)的可能發(fā)展方向。
總結(jié)
總的來(lái)說(shuō)，對(duì)于火熱了10年的類器官研究來(lái)說(shuō)，其存在的“血管化、免疫化、系統(tǒng)化”三大問題近年來(lái)已有不同研究團(tuán)隊(duì)提出了不同的解決方案。雖然這些研究方案尚不圓滿，但是讓我們看到類器官研究上的更多可能。
盡管類器官研究仍有諸多問題需要解決，但是全球范圍內(nèi)不斷的學(xué)術(shù)突破也讓我們看到這些問題終將被一步步解決。而無(wú)論采用什么樣的解決方案，研究人員都需要高質(zhì)量的試劑支持。
來(lái)源：生物谷
關(guān)于我們 聯(lián)系我們 營(yíng)業(yè)執(zhí)照 全國(guó)服務(wù)電話：400-818-0021 嘉峪檢測(cè)版權(quán)所有 備案號(hào)：京ICP備14047019號(hào)-2 
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
