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近年來(lái)生物藥以其高效性、高安全性、高靶向性等優(yōu)勢(shì)得到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，很多藥企也紛紛布局，使我國(guó)生物醫(yī)藥得到了很快的發(fā)展。但是由于生物藥結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，我們對(duì)它的分析仍處于基礎(chǔ)階段，一定程度上限制了生物藥的發(fā)展?；诖?，我們介紹了幾種以蛋白為代表的生物藥分析方法。

 

一、液相色譜法

 

液相是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的純度與穩(wěn)定性的有力工具，常用的主要有三種，分別為反向高效液相色譜（RP-HPLC）、離子交換色譜（IEC）、分子排阻色譜（SEC）[1-3]。液相色譜法基本程序見圖1。

 

 

圖1 液相色譜法基本程序

 

1.1反向高效液相（RP-HPLC）

 

反向高效液相是以非極性固定相與含水的極性流動(dòng)相為基礎(chǔ)的分析方法。由于有機(jī)溶劑、疏水的相互作用及分離時(shí)所用pH值較低，容易使蛋白變形。然而該方法對(duì)幾種蛋白質(zhì)特別有用，并廣泛應(yīng)用于胰島素的質(zhì)量分析。

 

1.2離子交換色譜（IEC）

 

離子交換色譜主要是用來(lái)分離離子或可離解的化合物，一般酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離、堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑分離，根據(jù)離子與交換劑結(jié)合力的強(qiáng)弱可將不同離子進(jìn)行分離。它廣泛地應(yīng)用于有機(jī)和生物物質(zhì)，如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等的分離，在生物化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

 

1.3分子排阻色譜（SEC）

 

分子排阻色譜根據(jù)分子大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離，常用于檢測(cè)在水溶液中蛋白的聚集等物理穩(wěn)定性的變化。

 

二、光譜法

 

光譜法通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)吸收、輻射、散射光的定量分析可以提供有價(jià)值的信息，了解蛋白的含量、構(gòu)象及聚集情況[3]。主要方法如下：

 

2.1紫外可見吸收光譜（UV）

 

蛋白的紫外吸收主要來(lái)源于自帶有苯環(huán)共軛雙鍵的氨基酸，如，酪氨酸（Amax=274nm）、色氨酸（Amax=280nm）、苯丙氨酸（Amax=259nm）等。常規(guī)的測(cè)定一般選取280nm這一波長(zhǎng)，能夠比較靈敏的檢測(cè)蛋白濃度的相對(duì)變化。

 

2.2旋光色散（ORD）

 

旋光色散是研究光學(xué)活性材料的偏振角隨波長(zhǎng)變化的一種色散效應(yīng)。它通常以氙燈光源的單色光，在200～700nm光譜區(qū)域內(nèi)進(jìn)行研究。常用于區(qū)分不同構(gòu)象的結(jié)構(gòu)。

 

2.3圓二色譜（CD）

 

圓二色光譜(簡(jiǎn)稱CD)是應(yīng)用最為廣泛的測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法[4]，是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。它可以在溶液狀態(tài)下測(cè)定，較接近其生理狀態(tài)。而且測(cè)定方法快速簡(jiǎn)便，對(duì)構(gòu)象變化靈敏，所以它是目前研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要手段之一，并已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中。

 

 

圖2 蛋白4種二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

 

例如，天然胰島素的圓二色譜在208 nm和222 nm 處有最低橢圓率, 表示胰島素的天然結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋存在。在胰島素淀粉樣纖維形成的過(guò)程中, 208 nm 和222 nm 處的最低橢圓率增大并逐漸消失，隨后在216 nm 處出現(xiàn)最低橢圓率, 表明此時(shí)胰島素的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)為β-折疊。通過(guò)該方法可以檢測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的變化，比如，金屬離子在胰島素的淀粉樣纖維形成過(guò)程中, 有促進(jìn)胰島素由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)化的作用。

 

2.4熒光光譜

 

熒光探針技術(shù)是研究蛋白質(zhì)在水溶液中構(gòu)象的一種有效方法。利用它可以測(cè)定蛋白質(zhì)分子的疏水微區(qū)內(nèi)兩基團(tuán)的距離以及酶與底物結(jié)合過(guò)程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化等。

芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等具有固定的熒光特性，但是人們一般檢測(cè)其中量子效率較高的色氨酸和酪氨酸的熒光信號(hào)。重要的是由于色氨酸、酪氨酸疏水，在自然蛋白結(jié)構(gòu)中往往被隱匿在內(nèi)核，一旦其所處的環(huán)境發(fā)生變化，接觸到溶劑分子，熒光強(qiáng)度就會(huì)大大降低。因此，可以根據(jù)熒光光譜的變化監(jiān)測(cè)到蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。常用熒光光譜法來(lái)檢測(cè)蛋白的物理穩(wěn)定性，例如，硫黃素T檢驗(yàn)、ANS熒光檢驗(yàn)等。

2.4.1硫黃素T檢測(cè)

硫黃素T (Thioflavin T) 是一種熒光染料，可以和富含β折疊的結(jié)構(gòu)結(jié)合，例如α-突觸核蛋白纖維原、Tau纖維原等。一旦結(jié)合，硫黃素T的發(fā)射光譜就會(huì)發(fā)生紅移 ，并且熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)，這是一個(gè)很好的用來(lái)檢測(cè)纖維原形成的測(cè)試，也是將蛋白可見異物或微粒定量分析的重要手段。

原理[5]：硫黃素T能夠與β折疊的結(jié)構(gòu)結(jié)合，能夠產(chǎn)生熒光，而且β折疊的結(jié)構(gòu)越多，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，由此考察胰島素的物理穩(wěn)定性。

 

2.5傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜

 

在制劑研究中，F(xiàn)TIR和拉曼光譜的譜形對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化非常敏感，在蛋白變性的過(guò)程中，可以動(dòng)態(tài)觀察到蛋白內(nèi)部α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)的破壞以及蛋白聚集后分子間的β折疊作用等。此外，光譜分析的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是不僅可以檢測(cè)蛋白分子在溶液中的結(jié)構(gòu)變化，還可以用于檢測(cè)固態(tài)蛋白的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于凍干粉穩(wěn)定性研究很有價(jià)值。

 

2.6動(dòng)態(tài)和靜態(tài)光散射

 

蛋白結(jié)構(gòu)變性往往伴隨著分子聚集等現(xiàn)象，造成分子粒徑的變化，可以用光散射的方法觀察分子粒徑的變化監(jiān)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。該方法具有靈敏度高、速度快、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。

 

三、電泳法

 

在電場(chǎng)的作用下，不同蛋白由于所帶電荷以及分子量不同，在載體凝膠上具有特征性遷移率。在蛋白分析中最常用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,包括變性電泳和不性形電泳[6]。變性電泳中蛋白需要通過(guò)十二萬(wàn)基硫酸鈉（SDS）處理，破壞了大多數(shù)非共價(jià)鍵的弱相互作用，主要檢測(cè)分子量及化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化等。除了常規(guī)的電泳方法，其他還有等點(diǎn)聚焦電泳（IEF）、毛細(xì)管電泳（CE）,也常被用于蛋白和多肽樣品的分析。

 

四、總結(jié)

 

以上是蛋白藥物檢測(cè)分析的方法，在蛋白藥物的結(jié)構(gòu)分析、穩(wěn)定性研究中起著重要的作用。在藥物研發(fā)過(guò)程中，需要研發(fā)者根據(jù)不同需求，選用合適的方法，才能達(dá)到預(yù)期效果。

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1] 柯林楠,宋茂謙,高敏,陸云龍,母瑞紅.高效液相色譜法在貽貝黏蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息,2022,28(11):21-23+33.DOI:10.15971/j.cnki.cmdi.2022.11.019.

[2] Determining Spectroscopic Quantitation Limits for Misfolded Structures[J] . Brent S. Kendrick,John P. Gabrielson,Caroline Warly Solsberg,Eugene Ma,Libo Wang.Journal of Pharmaceutical Sciences . 2020 (1).

[3] 藥劑學(xué)人民衛(wèi)生出版社.

[4] Co-translational assembly of protein complexes[J] . Wells Jonathan N.,Bergendahl L. Therese,Marsh Joseph A..Biochemical Society Transactions . 2015 (6).

[5] Beyond amyloid proteins: Thioflavin T in nucleic acid recognition.[J] . Verma Smita,Ravichandiran Velayutham,Ranjan Nihar.Biochimie . 2021 (prep).

[6] 趙新穎,丁曉靜,陳亮.毛細(xì)管電泳技術(shù)在乳品蛋白分析中的應(yīng)用[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2020,11(17):5814-5819.DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2020.17.003.