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本文主要介紹了上海捷諾生物科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

 

一、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法） 的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)及組成

 

表 1 試劑盒主要組成成分

 

二、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）產(chǎn)品預(yù)期用途

 

本產(chǎn)品用于體外定性檢測人宮頸脫落細(xì)胞中 ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671 基因的甲基化狀態(tài)。

本產(chǎn)品適用于 12 種高危 HPV（hrHPV）基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型）檢測陽性的 30 歲以上女性人群，幫助識(shí)別是否需要進(jìn)行陰道鏡檢查，達(dá)到分流管理的目的。hrHPV 持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要病因，但大多數(shù)感染是一過性且無臨床癥狀，能夠通過自身免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)而清除，僅有極少數(shù) hrHPV 持續(xù)感染的患者可能會(huì)進(jìn)展為宮頸癌前病變甚至宮頸癌。

使用本產(chǎn)品檢測，當(dāng)檢測結(jié)果為陰性時(shí)，提示無宮頸病變或?qū)m頸病變級(jí)別較低的可能性較大，可避免陰道鏡及組織活檢檢查，做好定期復(fù)查；檢測結(jié)果為陽性時(shí)，提示宮頸病變級(jí)別較高的可能性大，需進(jìn)一步進(jìn)行陰道鏡和/或組織活檢檢查。該檢測不能替代宮頸細(xì)胞學(xué)檢查。

 

三、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的產(chǎn)品包裝規(guī)格

 

10 人份/盒。

 

四、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

 

本產(chǎn)品包括三個(gè)步驟：細(xì)胞裂解、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和實(shí)時(shí)熒光PCR。

步驟 1，細(xì)胞裂解：使用試劑盒內(nèi)的裂解液對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行裂解，釋放基因組 DNA；

步驟 2，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化：細(xì)胞裂解后用亞硫酸氫鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，DNA 上未發(fā)生甲基化的胞嘧啶 C 因脫氨基反應(yīng)變成尿嘧啶 U，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶 C 則不會(huì)被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；

步驟 3，實(shí)時(shí)熒光 PCR：以轉(zhuǎn)化后的 DNA 為模板做熒光 PCR擴(kuò)增，特異性的引物只能擴(kuò)增發(fā)生甲基化的基因，從而檢測 6 個(gè)基因 ASTN1（Marker1）、DLX1（Marker2）、ITGA4（Marker3）、RXFP3（Marker4）、SOX17（Marker5）、ZNF671（Marker6）的甲基化狀態(tài)。

本產(chǎn)品同時(shí)設(shè)置了內(nèi)部質(zhì)控 Marker QC 和 Marker QM，Marker QC 用于評(píng)估樣本 DNA 是否足量以及亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化質(zhì)量是否合格，Marker QM 用于評(píng)估女性樣本的正常甲基化狀態(tài)。

 

五、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）主要原材料的選擇

 

本產(chǎn)品的主要原材料包括：產(chǎn)品的主要原材料有引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Eva Green 染料、SiHa 細(xì)胞和裂解液。這些原材料均是通過外購的方式獲得。

引物由上海捷諾自行設(shè)計(jì)，由合成公司經(jīng)過合成和純化后獲得；Taq DNA 聚合酶由原材料供應(yīng)商重組表達(dá)純化后獲得；dNTPs 由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得。

上海捷諾對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

 

六、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的企業(yè)參考品設(shè)置情況

 

該產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、最低檢出限參考品，組成如下：

陽性參考品包括 7 種，分別命名為陽性參考品 P1~P7，其中陽性參考品 P1~P3 為一定細(xì)胞量下不同甲基化比率的樣本；陽性參考品 P4~P5 為不同濃度的 SiHa 細(xì)胞；陽性參考品 P6 為人宮頸鱗癌細(xì)胞樣本；陽性參考品 P7 為人宮頸腺癌細(xì)胞樣本。

陰性參考品包括 5 種，分別命名為陰性參考品 N1~N5，其中陰性參考品 N1 為 IL-17 基因甲基化的人宮頸脫落細(xì)胞；N2 為 STK31基因甲基化的人宮頸脫落細(xì)胞；N3 為 DNMT1 基因甲基化的人宮頸脫落細(xì)胞；N4 為 IFFO1 基因甲基化的人宮頸脫落細(xì)胞；N5 為卵巢癌患者的宮頸脫落細(xì)胞。

精密度參考品包括 3 種，分別命名為精密度參考品 C1~C3，其中精密度參考品 C1 為中高甲基化比率的樣本；精密度參考品 C2 為低甲基化比率樣本；精密度參考品 C3 為 6 個(gè)標(biāo)志物非甲基化的人宮頸脫落細(xì)胞樣本。

最低檢出限參考品包括 6 種，分別命名為最低檢出限參考品S1~S6，為經(jīng)過系列稀釋后的 6 個(gè)不同甲基化比率的細(xì)胞樣本。

本試劑盒設(shè)置了陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，用于檢測過程中試劑盒和儀器的質(zhì)量控制。此外，每個(gè)樣本均檢測 2 個(gè)內(nèi)部質(zhì)控，用于結(jié)果的判讀和評(píng)估樣本的質(zhì)量。

 

七、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

 

上海捷諾對(duì)試劑盒反應(yīng)體系的研究包括引物濃度的確定、PCR 反應(yīng)液的選擇、反應(yīng)體積的確定、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒的確定等；對(duì)PCR 反應(yīng)條件的研究包括兩步法與三步法、退火溫度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化；對(duì)樣本的用量以及樣本保存時(shí)間進(jìn)行了研究；對(duì)基線和閾值的確定。

通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。上海捷諾根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。

 

八、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的分析性能評(píng)估研究

 

該產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度、最低檢出限、分析特異性、包容性、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒研究。準(zhǔn)確度研究中，上海捷諾分別使用三批次試劑盒對(duì)陽性參品和陰性參考品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示陽性參考品符合率、陰性參考品符合率均為 100%。同時(shí)使用若干臨床樣本對(duì)試劑盒準(zhǔn)確性進(jìn)行了研究，檢測結(jié)果與臨床金標(biāo)準(zhǔn)診斷方法學(xué)（病理學(xué)）結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，得出 CIN2+和 CIN3+的臨床靈敏度分別是 83.05%和 89.47%，臨床特異性分別是 84.55%和 78.44%。

精密度研究通過不同地點(diǎn)、人員、輪次、日間和批次對(duì)中強(qiáng)陽性、弱陽性以及陰性樣本進(jìn)行連續(xù) 20 天精密度研究，本試劑盒檢測結(jié)果的 Ct 值變異系數(shù)（CV）均不大于 5.0%。最低檢出限研究，以陰性宮頸脫落細(xì)胞樣本為基質(zhì)，對(duì)不同甲

基化比率的模擬樣本和臨床陽性稀釋樣本進(jìn)行檢測，得到宮頸脫落細(xì)胞樣本的檢測限，6 個(gè)基因的最低檢出限如下表：

 

 

分析特異性研究包含交叉反應(yīng)和干擾研究，交叉反應(yīng)研究結(jié)果表明試劑盒檢測非目標(biāo)的其他基因甲基化陽性的宮頸脫落細(xì)胞樣本，均無交叉反應(yīng)。

干擾實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，宮頸脫落細(xì)胞樣本中含有以下干擾物質(zhì)：500mg/dL 血紅蛋白、1×106個(gè)/mL 白細(xì)胞、宮頸粘液、20mg/mL替硝唑陰道片、174mg/mL 保婦康栓、100mg/mL 重組干擾素 α2b 凝膠、潤滑劑，對(duì)本試劑盒的檢測結(jié)果無影響。

包容性研究，上海捷諾對(duì)不同宮頸癌組織類型樣本的適用性進(jìn)行研究，對(duì)宮頸癌組織類型為鱗癌、腺癌、腺鱗癌樣本研究結(jié)果表明，本試劑盒適用于不同宮頸癌組織類型。

上海捷諾采用臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒性能研究，并根據(jù)與本試劑盒的組合性能研究結(jié)果，確定推薦的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒符合檢測要求。

 

九、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的陽性判斷值或參考區(qū)間研究

 

本產(chǎn)品陽性判斷值的研究采用臨床來源的宮頸脫落細(xì)胞樣本。

636 例樣本中≤CIN1 病例 503 例，CIN2 病例 85 例，≥CIN3 病例48 例。上海捷諾使用本產(chǎn)品和一代測序分別檢測上述樣本中 6 個(gè)基因的甲基化情況，以一代測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用 ROC 曲線法確定每個(gè)基因 ΔCt 值的陽性判斷值。

以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用邏輯回歸分析方法確定模型中 6 個(gè)基因的權(quán)重，建立 6 個(gè)基因的評(píng)分，然后根據(jù)約登指數(shù)最大的原則確定最佳閾值，最終確定本試劑盒的陽性判斷值為 3。當(dāng) 6 個(gè)基因分值總和＜3 時(shí)，樣本檢測結(jié)果為陰性；當(dāng) 6 個(gè)基因分值總和≥3 時(shí)，樣本檢測結(jié)果為陽性。

 

十、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的穩(wěn)定性研究

 

上海捷諾對(duì)本產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，同時(shí)，對(duì)樣本的穩(wěn)定性也進(jìn)行了研究。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性：將三批次試劑盒置于 2～8℃條件下保存，在效期的第 0、8、10、12、14 個(gè)月各進(jìn)行一次檢測，試劑盒在生產(chǎn)后保存至 14 個(gè)月各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合產(chǎn)品技術(shù)要求，產(chǎn)品有效期可達(dá) 12個(gè)月。

此外，上海捷諾對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說明書的聲稱。

樣本穩(wěn)定性：上海捷諾對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明樣本在室溫下保存 4 周內(nèi)，在 2～8℃保存 12 周內(nèi)進(jìn)行檢測。常溫條件下，樣本運(yùn)輸時(shí)間不超過 3 天。