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如化合物存在酮式烯醇式互變現(xiàn)象，在進(jìn)行HPLC方法開發(fā)時(shí)則很可能出現(xiàn)同一化合物有兩個(gè)響應(yīng)接近的峰，或者是一個(gè)主峰伴隨一個(gè)較大的未知峰，特別是后一種情況，如果把酮式烯醇式互變產(chǎn)生的未知峰當(dāng)成雜質(zhì)峰，卻無論如何也精制不掉，造成錯(cuò)誤的判斷，甚至嚴(yán)重影響研究進(jìn)度。由于酮式烯醇式互變現(xiàn)象在藥物合成及其他研究環(huán)節(jié)屬于較為常見的情況，故有必要對(duì)此進(jìn)行說明和探討。

 

一、概念解析

 

醛、酮分子中由于羰基的影響，α-H變得活潑，具有酸性，所以帶有α-H的醛、酮具有互變異構(gòu)的性質(zhì)。在溶液中有α-H的醛、酮是以酮式和烯醇式互變平衡而存在的。如下圖所示：

 

 

有兩類結(jié)構(gòu)式在藥物領(lǐng)域非常常見：

 

    1）β-二羰基化合物，如乙酰丙酮及其衍生物，由于其具有活潑的α-H，經(jīng)常出現(xiàn)在藥物合成的起始物料和中間體中。

 

    2）苯酚衍生物或類似結(jié)構(gòu)，如頭孢羥氨芐，也屬于極為常見的情況。

 

二、互變異構(gòu)體的差異

 

以乙酰丙酮為例，酮式狀態(tài)為獨(dú)立的兩個(gè)碳氧雙鍵，而烯醇式狀態(tài)則形成共軛雙鍵。烯醇式的最大吸收波長(zhǎng)相對(duì)酮式向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)，且吸光度增加。酮式狀態(tài)沒有親水基團(tuán)，極性非常小，而烯醇式狀態(tài)有羥基，極性較大。

 

上述內(nèi)容說明酮式與烯醇式在物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)都可能存在差異，在HPLC上的表現(xiàn)就是烯醇式在反相色譜中保留較弱，出峰較早，且光譜圖、響應(yīng)值均有可能不同于酮式。

 

三、影響因素

 

1.溶劑極性

 

以乙酰乙酸乙酯為例，實(shí)驗(yàn)測(cè)得,在不同極性溶劑中乙酰乙酸乙酯的烯醇式含量有所差異[1]。表1 中列出18 ℃時(shí),在不同極性溶劑的稀溶液中乙酰乙酸乙酯的烯醇式異構(gòu)體的含量。

 

 

數(shù)據(jù)表明,溶劑介質(zhì)的極性越強(qiáng),其烯醇式含量越少。為什么有如此現(xiàn)象呢?乙酰乙酸乙酯分子重排后,形成的烯醇式結(jié)構(gòu)存在分子內(nèi)氫鍵,構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定性增加,因此在非極性溶劑中烯醇式結(jié)構(gòu)的含量較大;而在極性介質(zhì)中特別是含活潑氫的極性介質(zhì)中,其活潑氫與酮式結(jié)構(gòu)的羰基氧易于形成分子間氫鍵 ,比亞甲基上的氫競(jìng)爭(zhēng)羰基氧形成氫鍵的能力強(qiáng), 導(dǎo)致分子內(nèi)氫鍵形成能力較小,從而使亞甲基上的氫重排能力 減弱,因而,互變平衡有利于向酮式方向移動(dòng),使其烯醇式結(jié)構(gòu)明顯減少。

 

2.pH

 

由于烯醇式羥基上氫具有酸性，在高pH值下互變平衡向烯醇式偏移，因此酮式烯醇式互變異構(gòu)隨著pH的升高，烯醇式比例增加。

 

3.時(shí)間

 

以對(duì)羥基苯丙酮酸為例，其水溶液在室溫（約20℃）放置9小時(shí)以上，其互變異構(gòu)逐漸趨于平衡，此時(shí)水溶液中烯醇式的比例為17% [2]。

 

4.溫度

 

隨著溫度的升高, 烯醇含量降低。這是因?yàn)闇囟鹊纳? 分子的振動(dòng)加劇, 烯醇形成分子內(nèi)氫鍵的能力減弱[3]。

 

5.取代基

 

因α-H具有酸性，故醛、酮具有互變異構(gòu)的性質(zhì)，由此可推導(dǎo)出以下結(jié)論：1）一般情況下，如α-H附近有吸電子基團(tuán)，α-H酸性增強(qiáng)，則互變平衡狀態(tài)烯醇式比例增加；2）一般情況下，如α-H附近有給電子基團(tuán)，α-H酸性減弱，則互變平衡狀態(tài)烯醇式比例減少。下圖中數(shù)據(jù)可以看出丙酮中烯醇式/酮式的比值為2.5ppm,乙酰丙酮該值為3.6，苯酚則絕大部分為烯醇式結(jié)構(gòu)。

 

 

如α位附近取代基體積較大，具有立體障礙則不利于形成六元環(huán)的烯醇式結(jié)構(gòu)。

 

四、HPLC方法開發(fā)

 

1.初步評(píng)估

 

根據(jù)以上信息，在進(jìn)行酮式烯醇式互變異構(gòu)化合物的HPLC方法開發(fā)時(shí)，首先應(yīng)根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)式初步評(píng)估在預(yù)定色譜條件下的酮式烯醇式互變的趨勢(shì)。例如某個(gè)中間體為三氟乙酰丙酮衍生物，根據(jù)上文論述的規(guī)律，應(yīng)能初步判斷在反相色譜條件下，互變異構(gòu)主要以烯醇式為主。為了獲得單一的烯醇式峰，可以嘗試加大流動(dòng)性緩沖液pH,促進(jìn)烯醇式的羥基電離，使互變向烯醇式移動(dòng)，如選擇pH7.0磷酸鹽緩沖液。

 

如評(píng)估認(rèn)為是酮式為主，可以嘗試增大流動(dòng)性極性，即減少有機(jī)相初始比例，使互變向酮式方向移動(dòng)。也可以升高柱溫，以獲得單一色譜峰。

 

2.注意事項(xiàng)

 

由于互變異構(gòu)可能需要時(shí)間，某些情況下可能需要研究供試品處理方法，如稀釋劑與供試品溶液的放置時(shí)間。

 

如果供試品在稀釋劑和流動(dòng)性中的酮式與烯醇式比例相差太大，可能會(huì)造成溶劑效應(yīng)，表現(xiàn)出色譜行為異常。

 

如果供試品固體狀態(tài)和溶液狀態(tài)酮式與烯醇式比例相差較大，且互變平衡較慢，可能供試品溶液需要研究互變平衡的時(shí)間。

 

五、案例分析

 

1. β-二羰基化合物

 

β-二羰基化合物由于常見于起始物料和中間體中，出于保密的需要，不便用具體的實(shí)例說明，請(qǐng)讀者諒解?？梢酝嘎兜氖牵话阍擃惢衔锒季哂袠O其活潑的α-H，互變平衡中主要以烯醇式為主……

 

2.苯酚衍生物

 

以頭孢羥氨芐為例，2015年版中國(guó)藥典中收載的頭孢羥氨芐原料藥有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法流動(dòng)相A為：流動(dòng)相A 為0. 02mol/L磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀2. 72g，加水8 0 0m l使溶解，用lm o l / L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至5. 0，用水稀釋至1000ml，混勻）。

 

流動(dòng)相A用磷酸鹽緩沖液，pH值為5. 0，而不是常見的3.0（題外話：磷酸鹽在pH5.0沒有緩沖能力，滿滿的槽點(diǎn)）。本人雖然沒有經(jīng)歷過頭孢羥氨芐的研究工作，但也能推測(cè)，如果流動(dòng)相A是pH3.0就會(huì)存在酮式異構(gòu)體，在主峰后面出峰，所以需要提高流動(dòng)相pH，使互變異構(gòu)向烯醇式移動(dòng)。頭孢羥氨芐結(jié)構(gòu)式見下圖，酮式烯醇式互變異構(gòu)發(fā)生在左邊酚羥基上：