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今年浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、浙江省口腔疾病臨床研究中心、浙江省重點實驗室、浙江大學(xué)腫瘤中心聯(lián)合在Colloids and surfaces. B, Biointerfaces雜志發(fā)表題為 Nanomaterial-based cell sheet technology for regenerative medicine and tissue engineering 的文章。

 

在這篇綜述中，主要列出了光誘導(dǎo)細(xì)胞薄片技術(shù)、熱響應(yīng)細(xì)胞薄片技術(shù)、磁控制細(xì)胞薄片技術(shù)、活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞薄片技術(shù)四種不同類型的基于納米材料的細(xì)胞薄片技術(shù)、機(jī)理以及在組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面潛在的臨床應(yīng)用。

 

研究背景

 

納米材料是指在三維空間中具有至少一個納米尺寸（1-100nm）的材料；細(xì)胞薄片技術(shù)是一種新興的無支架組織工程新方法，它可以提高細(xì)胞的生存能力并輕松將細(xì)胞移植到目標(biāo)部位，是再生醫(yī)學(xué)和組織工程的熱門研究領(lǐng)域，其應(yīng)用場景涉及骨、肌腱、肢體、心臟組織、骨骼機(jī)、牙種植體等。雖然基于納米材料的細(xì)胞薄片技術(shù)有諸多優(yōu)勢，但是在將其應(yīng)用于臨床治療之前還需要進(jìn)行更多的基礎(chǔ)研究。

 

技術(shù)介紹

 

1、光誘導(dǎo)細(xì)胞薄片技術(shù)

 

通過光誘導(dǎo)得到的細(xì)胞薄片以TiO2為代表，由于TiO2材料自身的優(yōu)勢而賦予其較強(qiáng)的紫外吸收能力和高效光催化活性等特性，這些特性可以提高生物效應(yīng)的可用性，因此TiO2納米點是光誘導(dǎo)細(xì)胞片技術(shù)中最常用的納米材料。

 

在細(xì)胞薄片的制備過程中主要通過紫外線照射改變TiO2的疏水性來實現(xiàn)，原理如下所示：

 

一般情況下細(xì)胞外基質(zhì)是疏水的，沒有照射的TiO2納米點也是疏水性的，當(dāng)經(jīng)過紫外線照射后，通過照射轉(zhuǎn)移的能量將電子轉(zhuǎn)化為“光電子”，而失去電子的部分產(chǎn)生“電子·空穴對”。光電子將Ti4+轉(zhuǎn)換為Ti3+，同時，電子空穴將O3-氧化成氧原子，氧原子離開空穴后水填充氧空位而形成親水表面，這樣細(xì)胞片便從材料表面分離出來（如圖A）；

在氧空位被水填充后末端羥基（TiOHT）與NH3+相互作用，在表面和細(xì)胞片形成蛋白質(zhì)鍵，改變NH3+的數(shù)量和構(gòu)象。由于結(jié)合蛋白的量減少，細(xì)胞片從表面脫離（圖B）；

紫外線照射后電子在表面累積，導(dǎo)致細(xì)胞膜帶負(fù)電荷，而細(xì)胞片也帶負(fù)電，這樣兩者之間由于排斥而分離（圖C）；

在可見光照射下材料表面上的電子累積，蛋白質(zhì)被釋放，水層密度增加，最終也會導(dǎo)致細(xì)胞片的分離（圖D）。

 

 

2、熱響應(yīng)細(xì)胞薄片技術(shù)

 

通過熱響應(yīng)得到的細(xì)胞薄片以聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAM）為代表，這是一種可以在不同溫度之間來回切換親水性和疏水性的材料（溫度為37℃時，材料表面為疏水性；溫度為25℃時，材料轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性），但是基于該材料的水凝膠不能完全應(yīng)用于細(xì)胞片分離。碳納米管（carbon nanotubes , CNT）是一種典型的一維納米材料，不僅具有碳材料的固有性質(zhì)，還具有金屬材料的導(dǎo)電性和導(dǎo)熱性，其表現(xiàn)出的表面電荷、疏水性、親水性、表面化學(xué)性質(zhì)等有助于細(xì)胞薄片的脫離。

 

技術(shù)原理如下所示：

 

疏水性的多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes , MWCNTs）可以分散在PNIPAAM水凝膠中取代其親水性成分，這種取代性會隨著MWCNTs濃度的增加而增強(qiáng)，導(dǎo)致疏水性增強(qiáng)，有助于細(xì)胞的黏附，細(xì)胞的高黏附率和高增值率是細(xì)胞成功脫落的原因之一，最后通過降溫作用將疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性，促使細(xì)胞薄片的脫落（圖A-B）；

由有機(jī)PNIPAAM和無機(jī)粘土網(wǎng)絡(luò)組成的納米復(fù)合（nanocomposite , NC）水凝膠可以吸收更多的牛血清白蛋白，有助于細(xì)胞粘附，最后細(xì)胞大量聚集、增殖形成細(xì)胞薄片并完整脫落（圖C）。

 

 

3、磁控制細(xì)胞薄片技術(shù)

 

通過磁控制得到的細(xì)胞薄片以Fe3O4為代表，其優(yōu)異的導(dǎo)電性和低毒性使其在生物學(xué)中廣泛應(yīng)用。

 

技術(shù)原理如下所示：

 

首先用由磁納米顆粒（magnetic nanoparticles , MNP）制備的磁性陽離子脂質(zhì)體（magnetic nanoparticles , MCL）標(biāo)記細(xì)胞（圖A）；

然后將細(xì)胞培養(yǎng)在具有親水性和中性電荷表面的24孔板中，在培養(yǎng)皿底部施加磁性材料誘導(dǎo)細(xì)胞粘附；

最后將磁性材料移除，細(xì)胞片便不再粘附而轉(zhuǎn)移（圖B）。

 

 

4、活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞薄片技術(shù)

 

活性氧（ROS）是細(xì)胞氧化的產(chǎn)物，可參與代謝、凋亡、分化、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等，其包含的產(chǎn)物也可以用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)級聯(lián)的激活等，其來源分為細(xì)胞內(nèi)ROS和細(xì)胞外ROS，在細(xì)胞薄膜的制備中主要依賴細(xì)胞外ROS來獲得。

 

金納米顆粒（AuNPs）是一種普通的光敏劑，具有強(qiáng)的光吸收能力，其在綠色激光照射下可以吸收能量轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，并反應(yīng)產(chǎn)生ROS，因此可以通過AuNPs產(chǎn)生ROS的思路制備細(xì)胞薄片。

 

其技術(shù)原理如下所示：

 

金納米顆粒在綠色激光的照射下產(chǎn)生ROS，破壞了細(xì)胞薄片和材料之間的細(xì)胞膜，導(dǎo)致薄片的脫落（如圖）。

 

 

應(yīng)用場景

 

基于納米材料細(xì)胞薄片技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有研究將其應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，如光誘導(dǎo)制造的細(xì)胞薄片在于骨再生和牙種植中的應(yīng)用、磁控制制造的細(xì)胞薄片在骨再生、血管生成、心臟組織再生、骨骼機(jī)再生中的應(yīng)用（如圖所示）。

 

牙種植體骨整合

 

在牙種植手術(shù)中骨和種植體的結(jié)合占據(jù)關(guān)鍵位置，基于納米材料的光誘導(dǎo)細(xì)胞片技術(shù)是增強(qiáng)骨整合的潛在方法。研究發(fā)現(xiàn)通過光誘導(dǎo)獲得的骨髓干細(xì)胞薄片放置在牙植入物上后形成的復(fù)合物可以產(chǎn)生更加活躍的骨生長和骨整合。

 

骨增生

 

人類間充質(zhì)干細(xì)胞是常用的移植細(xì)胞，其具有分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的潛力。研究發(fā)現(xiàn)通過光誘導(dǎo)獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞薄片可以幫助骨再生，因為這兩種細(xì)胞共培養(yǎng)得到的細(xì)胞薄片具有預(yù)血管化的能力，而血管網(wǎng)絡(luò)可以參與骨的形成，最終造成骨增生。

 

心臟組織再生

 

心肌組織在疾病發(fā)生后再生能力有限，通過移植手段進(jìn)行治療后易發(fā)生術(shù)后免疫排斥等并發(fā)癥，細(xì)胞薄片可能為心臟組織再生提供新的選擇。研究發(fā)現(xiàn)利用磁控制方式制作的3D心臟模型有諸多優(yōu)勢，如組織中的心肌細(xì)胞可以均勻分布、可以自發(fā)收縮，并具有良好的收縮特性等等。