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2001年，Sharpless和Meldal 發(fā)表Cu(I) 催化的 [3+2] 環(huán)加成反應(yīng) (通常稱為“Click Chemistry”)的發(fā)現(xiàn)，這大大豐富了多肽蛋白偶聯(lián)的反應(yīng)手段。在Cu (I) 催化劑存在下，可以將含有炔基和疊氮基團(tuán)的不同多肽/蛋白片段通過(guò)click chemistry高度選擇性/正交性地偶聯(lián)在一起，構(gòu)建結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，生物功能性更強(qiáng)的多肽/蛋白大分子（圖1）。

圖1. Cu(I) 催化的Click Chemistry過(guò)程

Click chemsitry 本質(zhì)上屬于上世紀(jì)就發(fā)現(xiàn)的Huigsen 環(huán)加成反應(yīng)，但后者需要較高的反應(yīng)溫度和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，對(duì)于多肽合成來(lái)說(shuō)構(gòu)成穩(wěn)定性方面的問(wèn)題。在發(fā)現(xiàn)Cu (I) 催化后，Click chemistry可以實(shí)現(xiàn)在較低溫度（室溫）下很短時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)，通過(guò)炔基與疊氮之間環(huán)加成為三唑的反應(yīng)，極大地豐富了復(fù)雜多肽合成的反應(yīng)手段。這個(gè)反應(yīng)可以在諸如叔丁醇、乙醇或者水等極性溶劑中進(jìn)行。

Click chemistry在多肽合成領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用，不僅僅在于它可以將兩個(gè)多肽片段通過(guò)正交方式偶合在一起，組建更復(fù)雜的分子體系，而且也在于它可以將多肽骨架的酰胺鍵替換為等電體的三唑基團(tuán)，以提高多肽的化學(xué)穩(wěn)定性，或者賦予多肽分子新的特殊的空間結(jié)構(gòu)。

通常肽含有通過(guò)酰胺鍵連接的 L-氨基酸，這些氨基酸易受酶促肽鍵裂解。蛋白酶和肽酶，例如胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和二肽基肽酶 IV（DPP 4），能夠切割蛋白質(zhì)和肽中的特定位點(diǎn)。為了增加多肽藥物的穩(wěn)定性，很多非蛋白質(zhì)氨基酸被嵌入多肽分子之中，除此之外，包括末端封閉，環(huán)化，骨架修飾等諸多手段都被多肽藥物分子設(shè)計(jì)者所利用，以多肽類似物的手段提升多肽分子的成藥性。1,2,3-三唑作為酰胺的等電體，它在多肽類似物設(shè)計(jì)中的作用也逐漸受到重視。它們的空間尺寸、偶極矩、氫鍵受體等諸多方面都存在著較大的相似度。1,2,3-三唑環(huán)，具有sp2-雜化氮原子N(2) 和N(3)，可以作為弱氫鍵受體。并且1,2,3-三唑環(huán)的強(qiáng)偶極矩使 C(5) 質(zhì)子極化到可以充當(dāng)類似于酰胺 NH 的氫鍵供體的程度。此外，1,2,3-三唑環(huán)有一個(gè)大的偶極，可以與所處多肽中的其他酰胺在二級(jí)結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)。重要的是，1,2,3-三唑?qū)λ鈽O為穩(wěn)定?？傮w而言，1,2,3-三唑可以成為多肽類似物中酰胺鍵的潛在替代物。

Click化學(xué)在多肽合成中的應(yīng)用：

一三唑環(huán)替換二硫鍵

2011 年Empting 等人首先使用 1,5-二取代的 1,2,3-三唑作為二硫鍵的替代物。 1,5-二取代的 1,2,3-三唑是在釕 (II)-催化反應(yīng)(RuAAC) 中生成的。他們將 1,4- 和 1,5-二取代的 1,2,3-三唑引入向日葵胰蛋白酶抑制劑-I (SFTI-1[1,14]) 的單環(huán)變體中，通過(guò)click chemistry取代二硫鍵，并且表明 1,5-二取代三唑類似物與 1,4-二取代三唑類似物相比保留了幾乎全部的生物活性。同年，Morten Meldal (2022年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主之一) 等人使用 1,4-二取代的 1,2,3-三唑取代 tachyplesin I (TP-I) 中的兩個(gè)二硫鍵，這是一種具有抗菌活性的 17 個(gè)殘基雙環(huán)肽。TP-I在其活性形式中具有β-發(fā)夾帶狀結(jié)構(gòu)，三唑環(huán)類似物可以模仿 TP-1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生抗菌活性。

二替代芳香環(huán)和雙鍵

除了用作酰胺鍵和二硫鍵的替代物外，1,2,3-三唑在小分子藥物設(shè)計(jì)中還經(jīng)常被賦予模擬芳香環(huán)、?；姿狨ズ头词较N替代物的角色。目前還沒(méi)有關(guān)于多肽藥物修飾中這種替代的報(bào)道。1,2,3-三唑是堿性芳族雜環(huán)化合物，可能無(wú)法直接替代中性芳族 Phe 和 Tyr 側(cè)鏈。然而，在某些情況下，替代物可能有助于增強(qiáng)結(jié)合親和力或生物活性。因此，可以在未來(lái)的多肽藥物或許能發(fā)現(xiàn)它的作用。

三β-轉(zhuǎn)角替代物

多肽藥物的空間結(jié)構(gòu)對(duì)于它們的成藥性起著至關(guān)重要的作用，Guan等人通過(guò) Cu(I) 催化的兩條肽鏈末端之間的炔烴-疊氮化物環(huán)加成構(gòu)建 β-轉(zhuǎn)角模擬單元，根據(jù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，他們提出用疊氮化物和末端炔烴衍生的肽鏈之間的環(huán)加成可能提供合成β-轉(zhuǎn)角單元的方法。 他們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列具有不同間隔長(zhǎng)度的 1,4-二取代 1,2,3-三唑基四肽，并通過(guò) NMR 和 FT-IR 對(duì)其進(jìn)行了表征。他們發(fā)現(xiàn)三唑系統(tǒng)形成β-轉(zhuǎn)角的趨勢(shì)在很大程度上取決于手臂長(zhǎng)度。三碳手臂（圖2）是穩(wěn)定 β 轉(zhuǎn)角形成的最佳選擇。

圖2. 形成β 轉(zhuǎn)角最佳結(jié)構(gòu)的三唑多肽

四三唑多肽環(huán)化

Click chemistry 為合成環(huán)肽提供了重要的手段。多肽首尾環(huán)化是增加肽結(jié)構(gòu)剛性和穩(wěn)定性的重要途徑。外切蛋白酶可以識(shí)別N-或C-末端基團(tuán)并水解多肽分子，因此多肽首尾環(huán)化可以顯著增加分子的外切酶水解穩(wěn)定性。Morten Meldal 使用銅催化的閉環(huán)反應(yīng)制備了首尾環(huán)化的多肽分子（圖 3）。關(guān)鍵步驟的click chemistry是在2當(dāng)量的CuI催化，并在50當(dāng)量的DIPEA存在下過(guò)夜完成的。該反應(yīng)也可以在其它活性氨基酸側(cè)鏈不保護(hù)的情況下實(shí)現(xiàn)。

圖3. Click Chemistry介導(dǎo)的環(huán)肽結(jié)構(gòu)

常規(guī)的酰胺化環(huán)化很難實(shí)現(xiàn)四元肽的環(huán)化，但三唑環(huán)化卻可以突破這一限制。一項(xiàng)研究返現(xiàn)，從對(duì)酪氨酸酶具有潛在抑制活性的細(xì)菌中分離出的模型四肽：環(huán)-[Pro-Val-Pro-Tyr] 由于過(guò)大的張力很難用傳統(tǒng)的肽環(huán)化合成（盡管存在兩個(gè)有利于環(huán)化的Pro殘基）。但當(dāng)Pro-Val之間的酰胺鍵被三唑環(huán)替代后，環(huán)化可以順利完成（圖4）。

圖4. 環(huán)-[Pro-Val-Pro-Tyr]（左）和三唑環(huán)類似物（右）

五生物共軛反應(yīng)

生物共軛是共價(jià)連接兩個(gè)或多個(gè)生物分子結(jié)構(gòu)單元，以開(kāi)發(fā)雙功能和多功能分子的過(guò)程。 它還包括將合成分子連接到諸如碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子上，用于各種體內(nèi)治療和成像應(yīng)用。 Sharpless 小組的開(kāi)創(chuàng)性工作使點(diǎn)擊化學(xué)成為生物醫(yī)學(xué)研究中的強(qiáng)大工具。 點(diǎn)擊化學(xué)因其具有生物正交性、生物相容性、化學(xué)選擇性和立體特異性潛力而在生物偶聯(lián)中獲得了特殊的重要性。

碳水化合物在從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)到病原體防御的不同生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 糖基化多肽在藥物研發(fā)過(guò)程中起著越來(lái)越重要的作用，例如在疫苗、治療劑和抗生素領(lǐng)域。 click chemistry為實(shí)現(xiàn)糖基化多肽的合成提供了強(qiáng)大的工具。圖5的多肽類似物就是通過(guò)click chemistry實(shí)現(xiàn)的糖基化多肽結(jié)構(gòu)，應(yīng)用于抗癌候選疫苗 。

圖5. 三唑手臂糖基化多肽疫苗

六總結(jié)

Click chemistry已廣泛用于多肽藥物的研究。三唑環(huán)已被作為酰胺鍵和二硫鍵的替代物廣泛引入多肽類似物分子中，這對(duì)于多肽化學(xué)修飾以增加代謝穩(wěn)定性非常有用。由于click chemistry的選擇性、高效性以及溫和的反應(yīng)條件，它成為了多肽化學(xué)修飾的重要武器，例如多肽片段縮合，肽環(huán)化，以及包括糖基化在內(nèi)的修飾，都可以利用click chemistry實(shí)現(xiàn)。三唑的引入可以模擬或促進(jìn)肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，與各種功能結(jié)構(gòu)或基團(tuán)（如碳水化合物、聚乙二醇和放射性標(biāo)記/光標(biāo)記試劑）縮合可以有效增加肽的功能。盡管click chemistry在多肽藥物研究中是一種吸引人的方法，但迄今為止在開(kāi)發(fā)臨床藥物中并不常見(jiàn)。三唑類在生物系統(tǒng)中的代謝途徑有待進(jìn)一步研究。此外，oligomerization副反應(yīng)也需要有效控制。盡管點(diǎn)擊化學(xué)存在潛在限制，但它促進(jìn)多肽藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域內(nèi)必將發(fā)揮更大的潛力，或許不久的將來(lái)，三唑結(jié)構(gòu)的身影也能出現(xiàn)在上市多肽藥物或者診斷試劑之中。