您當(dāng)前的位置：檢測(cè)資訊 > 科研開(kāi)發(fā)
嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-10-14 23:47
摘 要 / Abstract
發(fā)酵類中藥歷史悠久，但目前對(duì)其研究尚不夠深入，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有待完善提高。本文對(duì)發(fā)酵類中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究、分類、質(zhì)量控制現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，旨在闡明目前發(fā)酵類中藥質(zhì)量控制中存在的問(wèn)題，為后續(xù)質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。
Fermented traditional Chinese medicine (TCM) has a long history,but research in this field is not sufficient and the quality control standards need to be improved.This article reviews studies on the material basis,classification and quality control status of fermented TCM,aiming to clarify current problems in the quality control of fermented TCM,and provide insights for further improving quality control standards.
關(guān) 鍵 詞 / Key words
發(fā)酵；中藥；質(zhì)量控制；研究進(jìn)展
fermentation; traditional Chinese medicine; quality control; research progress
中藥發(fā)酵屬于炮制方法的一種，是指取待炮制品加規(guī)定的輔料拌勻后，制成一定形狀，置適宜的濕度和溫度下，使微生物生長(zhǎng)至其中酶含量達(dá)到規(guī)定程度，曬干或低溫干燥[1]。中藥的發(fā)酵炮制方法始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》。
發(fā)酵類中藥既可以直接作為飲片用于臨床，也可以作為眾多中成藥的原料或處方組成，其真?zhèn)蝺?yōu)劣直接影響臨床效果。發(fā)酵類中藥應(yīng)用廣泛，種類繁多，但由于各地處方及發(fā)酵工藝不統(tǒng)一、缺少發(fā)酵類中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法，導(dǎo)致發(fā)酵類中藥產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。本文對(duì)發(fā)酵類中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究、分類、質(zhì)量控制現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，闡述發(fā)酵類中藥現(xiàn)存問(wèn)題，以期為該類產(chǎn)品質(zhì)量控制研究提供參考。
01 物質(zhì)基礎(chǔ)研究
發(fā)酵類中藥可能是通過(guò)轉(zhuǎn)化的化學(xué)成份、菌種代謝產(chǎn)物等發(fā)揮作用，針對(duì)這些物質(zhì)基礎(chǔ)已有許多相關(guān)報(bào)道。
1.1 消化酶
發(fā)酵時(shí)空氣中的水分子是微生物生長(zhǎng)的溫床，在其發(fā)揮催化作用的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的消化酶。消化酶種類繁多，有纖維素酶系、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶等。目前在發(fā)酵類中藥研究中，對(duì)消化酶的研究較多。整理常見(jiàn)發(fā)酵類中藥產(chǎn)生酶的種類，如表1所示。
1.2 化學(xué)成份轉(zhuǎn)化降解
1.2.1 低聚糖
發(fā)酵類中藥的低聚糖來(lái)源有2條途徑。途徑1：對(duì)于米面為基質(zhì)的曲類，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶等消化酶，酶作用于底物產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖。途徑2：在發(fā)酵過(guò)程中，原藥材中某些糖苷類成份被降解，失去糖配基。張超[12]采用苯酚-硫銨法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的半夏曲中總多糖含量，結(jié)果顯示，含量先增加后減少，原因是發(fā)酵初期大分子物質(zhì)被產(chǎn)生的酶逐步酶解成低聚糖，后期微生物消耗產(chǎn)生的糖。劉洋等[13]、Magrini等[14]采用復(fù)合益生菌分別對(duì)王不留行、益母草、黃芪進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定多糖含量，結(jié)果顯示，多糖含量均增加。
1.2.2 脂肪酸
當(dāng)發(fā)酵類中藥的原藥材含有較多的油脂及不溶性酯類時(shí)，產(chǎn)物會(huì)包含長(zhǎng)鏈脂肪酸及小分子酸性物質(zhì)，如六神曲發(fā)酵后酸度增加[15]、半夏曲中甘草次酸含量會(huì)隨發(fā)酵而升高[16]等。但對(duì)于酸類物質(zhì)的具體來(lái)源及機(jī)制暫無(wú)明確的研究闡述，僅有結(jié)論，后續(xù)可作為研究方向。
1.2.3 活性成份轉(zhuǎn)化
林王敏等[17]、王麗芳等[18]、杜晨暉等[19]分別對(duì)淡豆豉、六神曲、酸棗仁發(fā)酵前后成份轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，均存在黃酮苷類物質(zhì)脫糖基轉(zhuǎn)化為苷元的現(xiàn)象，發(fā)酵后苷元含量上升，為發(fā)酵類中藥成份尋找質(zhì)量控制指標(biāo)提供了參考思路。另外，可以利用微生物將苷轉(zhuǎn)化為苷元這一作用，人工制備不易得到的苷元，如王永宏[20]通過(guò)微生物發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)了梔子中有效成份梔子苷元京尼平的制備。
除苷向苷元轉(zhuǎn)化外，還可利用發(fā)酵提高其他種類有效成份的轉(zhuǎn)化。如甘草發(fā)酵后甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸[21]、黃芪經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵后總黃酮和總皂苷含量增加[22]、將人參中含量較高的人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為生物活性更高的稀有人參皂苷C-K[23]等。因此，發(fā)酵可作為輔助中藥提取、提高中藥有效成份利用率的有效方法。
1.2.4 有毒物質(zhì)降解
發(fā)酵作為炮制技術(shù)的一種，具有增效減毒的作用。發(fā)酵類中藥化風(fēng)丹中生物堿類成份既是指標(biāo)成份也是毒性成份。馬奮剛等[24]測(cè)定發(fā)酵前后化風(fēng)丹中次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿3種雙酯型生物堿及苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿3種單酯型生物堿的含量，結(jié)果表明，發(fā)酵后毒性較大的雙酯型生物堿含量下降，而單酯型生物堿含量上升，提示可能存在2種生物堿間的轉(zhuǎn)化。朱舟等[25]利用天南星與白僵菌雙向發(fā)酵得到抗驚厥藥效不變、半數(shù)致死量(LD50)增大2倍、毒性較小的產(chǎn)物，達(dá)到減毒的目的。
1.3 菌種變化
微生物是發(fā)酵炮制的核心，發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類、數(shù)量、優(yōu)勢(shì)菌種等均處在動(dòng)態(tài)變化中，對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中菌種變化的監(jiān)測(cè)有利于篩選優(yōu)勢(shì)菌并進(jìn)行分離鑒定，為后期實(shí)現(xiàn)純種菌發(fā)酵及質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。朱海針等[26]、龍凱等[27]、陳彥琳等[28]分別采用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)淡豆豉、半夏曲、六神曲中微生物種類的變化，總結(jié)菌種變化的規(guī)律并確定優(yōu)勢(shì)菌種，為后續(xù)該類中藥實(shí)現(xiàn)純種菌發(fā)酵提供參考。
上述對(duì)于微生物的鑒定均采用傳統(tǒng)分離和高通量測(cè)序技術(shù)，該方法前期處理耗時(shí)較長(zhǎng)且鑒定結(jié)果需人工整理，無(wú)法直觀給出。目前，隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)以其靈敏度、準(zhǔn)確度高且能進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用日益廣泛，在微生物鑒定領(lǐng)域，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、敞開(kāi)式離子化質(zhì)譜(AI-MS)技術(shù)以其分析時(shí)間短、檢測(cè)成本低、信息直觀、易于操作等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為微生物檢測(cè)的重要方式[29-32]。但目前未見(jiàn)該技術(shù)應(yīng)用于發(fā)酵類中藥的微生物群落鑒定，可作為日后研究的方向。
1.4 真菌毒素
真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括霉菌毒素和蕈菌毒素，易產(chǎn)生致癌、致突變作用。為避免真菌毒素對(duì)用藥安全的影響，應(yīng)嚴(yán)格檢測(cè)和控制真菌毒素的含量，發(fā)酵類中藥更應(yīng)注重該安全性指標(biāo)的控制。李汶等[33]、張雪輝等[34]分別采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、高效液相色譜法與熒光光度法檢測(cè)常見(jiàn)中藥淡豆豉、生建曲、六神曲及含有六神曲的中成藥保和片、含有淡豆豉的中成藥銀翹解毒片中黃曲霉毒素含量，結(jié)果顯示，藥材中黃曲霉毒素B1含量差距較大，提示發(fā)酵類中藥有可能被黃曲霉毒素污染，應(yīng)加強(qiáng)檢測(cè)。另外，發(fā)酵類產(chǎn)品不應(yīng)只關(guān)注黃曲霉毒素，如赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、肉毒毒素等作為常見(jiàn)的真菌毒素，在發(fā)酵類中藥中卻鮮有報(bào)道[35-37]。
02 發(fā)酵類中藥的分類
2.1 按發(fā)酵方式分類
按發(fā)酵方式分為傳統(tǒng)自然發(fā)酵和現(xiàn)代純種菌發(fā)酵。傳統(tǒng)自然發(fā)酵是指在適宜溫濕度條件下，借助空氣中存在的菌種發(fā)泡或產(chǎn)生霉衣。目前，對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵中“適宜”二字的定義并不具體，但發(fā)酵順利與否受溫濕度條件影響較大。同時(shí)，傳統(tǒng)自然發(fā)酵終點(diǎn)的辨別仍需人工經(jīng)驗(yàn)輔助，摻雜了主觀臆斷的可能。另外，參與傳統(tǒng)自然發(fā)酵的微生物種類和數(shù)量存在較大的不確定性。以上因素均不利于統(tǒng)一的質(zhì)量控制。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，微生物的分離鑒定越來(lái)越普遍，這使優(yōu)勢(shì)菌種的選擇和純種菌發(fā)酵成為可能。現(xiàn)代純種菌發(fā)酵嚴(yán)格控制發(fā)酵溫濕度、參與催化分解作用的微生物種類和數(shù)量等，從發(fā)酵原藥材的挑選、菌種的選擇、發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)化等方面保證發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)控制[38]。與傳統(tǒng)自然發(fā)酵相比，現(xiàn)代純種菌發(fā)酵能夠更好地進(jìn)行質(zhì)量控制，但目前市場(chǎng)上大多數(shù)發(fā)酵類中藥仍采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式。
2.2 按發(fā)酵技術(shù)手段分類
2.2.1 固態(tài)發(fā)酵
固態(tài)發(fā)酵是指在固態(tài)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行微生物發(fā)酵的過(guò)程，基質(zhì)中幾乎無(wú)自由流動(dòng)的水，起源于古代炮制技術(shù)中的制曲工藝，包括藥材預(yù)處理、微生物選擇、發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化等步驟[39]。該發(fā)酵技術(shù)操作簡(jiǎn)便、設(shè)備和場(chǎng)地要求較低，但發(fā)酵環(huán)境處于開(kāi)放狀態(tài)、發(fā)酵終點(diǎn)的確定依賴經(jīng)驗(yàn)、參與發(fā)酵的菌種不固定且未對(duì)基質(zhì)進(jìn)行滅菌[40]，導(dǎo)致成品存在批間差異，市場(chǎng)上流通的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。六神曲、建曲、半夏曲、淡豆豉、百藥煎等均屬于固體發(fā)酵。
2.2.2 液體發(fā)酵
液體發(fā)酵是在融合了抗生素制備工藝的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，將優(yōu)勢(shì)菌種的菌絲接種在培養(yǎng)基上，發(fā)酵產(chǎn)物為菌絲體和次級(jí)代謝產(chǎn)物。該發(fā)酵技術(shù)解決了固體發(fā)酵中混合菌株開(kāi)放式發(fā)酵的問(wèn)題，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，成為發(fā)酵類中藥大生產(chǎn)的主要方式。如利用真菌糙皮側(cè)耳制備的黨參發(fā)酵液鎮(zhèn)痛效果顯著提高[41]、積雪草經(jīng)黑曲霉JH-2菌株液體發(fā)酵后積雪草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高3倍[42]等。
2.2.3 雙向發(fā)酵
雙向發(fā)酵技術(shù)起源于固態(tài)發(fā)酵，區(qū)別在于將固態(tài)發(fā)酵中農(nóng)副產(chǎn)品等營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)以具有一定活性成份的藥材或藥渣替代，并接種優(yōu)選菌種進(jìn)行發(fā)酵的制備手段[43]。如利用毛霉、曲霉、青霉等微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷、葛根素、黃芩苷等[44]。雙向發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)了中藥的二次利用，增加了中藥有效成份的利用率，提高藥效，目前研究廣泛[45-46]，常見(jiàn)的紅曲為該類發(fā)酵技術(shù)所得。
2.3 按發(fā)酵基質(zhì)分類
2.3.1 米面曲類
米面曲類中藥是以米面等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)物。作為發(fā)酵類中藥中最為常見(jiàn)的曲類，最早的記載可追溯到商周時(shí)期的《禮記》。以曲類形式入藥，最早見(jiàn)于東漢張仲景所撰《金匱要略》中的 “薯蕷丸”[47]。
目前，常見(jiàn)的米面曲類有六神曲、建曲、半夏曲、紅曲、沉香曲、采云曲等。其中，臨床需求量排名前三的分別為紅曲、建曲和六神曲[48]。米面曲類處方差異較大，有幾味藥材組成的如六神曲，也有幾十味藥材組成的如漳州神曲。由于米面曲類處方組成各地差異較大、生產(chǎn)工藝處于半工業(yè)化階段等原因，質(zhì)量控制仍處于起步階段，市場(chǎng)上以次充好的質(zhì)量問(wèn)題大肆泛濫，長(zhǎng)此以往，臨床需求萎縮、曲類中藥發(fā)展受阻等問(wèn)題將不斷呈現(xiàn)。因此，統(tǒng)一米面曲類中藥的處方配比、規(guī)范生產(chǎn)工藝、制定質(zhì)量控制方法、形成完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。
2.3.2 膽汁發(fā)酵類
膽汁發(fā)酵類中藥是以來(lái)源于豬、牛、羊、雞等的膽汁為基質(zhì)、具有藥效的中藥為底物進(jìn)行雙向發(fā)酵的產(chǎn)物，常見(jiàn)的有膽南星、體外培育牛黃、化風(fēng)丹、膽黃連等[49-50]。其中，膽南星已作為發(fā)酵加工品收錄于《中國(guó)藥典》2020年版一部。目前，膽汁發(fā)酵類中藥的發(fā)展受制于膽汁來(lái)源不同，發(fā)酵工藝各異，發(fā)酵時(shí)間少則幾天多達(dá)數(shù)月，性狀的描述多為氣微腥味苦，受人為經(jīng)驗(yàn)影響等因素。未來(lái)需繼續(xù)發(fā)掘適用于膽汁發(fā)酵的藥材、對(duì)膽汁來(lái)源進(jìn)行說(shuō)明、規(guī)范發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。
2.3.3其他類
除以米面等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或膽汁作為發(fā)酵基質(zhì)外，還有直接使用藥材不外加基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的中藥，如淡豆豉、百藥煎、青黛、冬蟲夏草菌粉等。其中，淡豆豉已作為發(fā)酵加工品收錄于《中國(guó)藥典》2020年版一部，質(zhì)量控制方法較為成熟。
03 質(zhì)量控制現(xiàn)狀
查閱《中國(guó)藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)、各省中藥飲片炮制規(guī)范中發(fā)酵類中藥的收錄情況可以發(fā)現(xiàn)，目前該類中藥仍多以性狀鑒別為主，大部分無(wú)統(tǒng)一的處方及工藝規(guī)范，缺乏量化的、體現(xiàn)藥效的、具有發(fā)酵類中藥特色的質(zhì)控指標(biāo)，質(zhì)量控制技術(shù)手段和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)處于不成熟階段。本文將從以下2個(gè)方面對(duì)發(fā)酵類中藥的質(zhì)量控制現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。
3.1 處方及工藝
處方比例和發(fā)酵工藝的不同，將會(huì)影響發(fā)酵類中藥的臨床療效。整理不同標(biāo)準(zhǔn)中常見(jiàn)發(fā)酵類中藥的處方及工藝，如表2所示。
3.2 質(zhì)量控制方法
對(duì)于發(fā)酵類中藥，目前的質(zhì)量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查等，如表3所示。
除《中國(guó)藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)、各省中藥飲片炮制規(guī)范中有對(duì)發(fā)酵類中藥具體成份進(jìn)行含量測(cè)定外，現(xiàn)代研究認(rèn)為，消化酶是能反映發(fā)酵類中藥質(zhì)量的指標(biāo)[51-53]。目前，針對(duì)發(fā)酵類中藥酶活力測(cè)定方法按照原理主要分為2類：測(cè)定底物的消耗量和測(cè)定酶解產(chǎn)物的量。常用的方法有碘淀粉比色法、3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法、福林酚法、對(duì)-硝基苯磷酸鹽(pNPP)法、對(duì)-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)法、纖維蛋白平板法等?，F(xiàn)將有關(guān)報(bào)道匯總?cè)绫?所示。
04 總 結(jié)
4.1 統(tǒng)一處方組成，優(yōu)化規(guī)范生產(chǎn)工藝
目前，發(fā)酵類中藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后，地方標(biāo)準(zhǔn)較多，且各地標(biāo)準(zhǔn)處方組成或配比不同、發(fā)酵方式及工藝參數(shù)不統(tǒng)一、質(zhì)量控制技術(shù)和方法落后，直接影響了產(chǎn)品的質(zhì)量和安全控制。其中，處方組成項(xiàng)中涉及的發(fā)酵用輔料尚無(wú)統(tǒng)一的來(lái)源及規(guī)格規(guī)定，如膽汁、黃酒、面粉等，應(yīng)予以明確并制定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
另外，發(fā)酵類中藥在大生產(chǎn)中仍多采用固體發(fā)酵及傳統(tǒng)自然發(fā)酵的方式，而涉及優(yōu)勢(shì)菌種、提高有效成份轉(zhuǎn)化、提高生產(chǎn)效率的液體發(fā)酵和雙向發(fā)酵技術(shù)僅停留在實(shí)驗(yàn)室成果階段，并未規(guī)模化轉(zhuǎn)化應(yīng)用。因此，后續(xù)應(yīng)關(guān)注優(yōu)勢(shì)菌種的篩選及高效發(fā)酵技術(shù)手段和生產(chǎn)工藝的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。
4.2 開(kāi)展發(fā)酵過(guò)程及物質(zhì)基礎(chǔ)研究
除了配方本身的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)酵類中藥由于微生物的參與，會(huì)具有產(chǎn)生消化酶及次生代謝產(chǎn)物、原成份發(fā)生轉(zhuǎn)化降解、優(yōu)勢(shì)菌種逐漸顯現(xiàn)并且引入真菌毒素對(duì)用藥安全性產(chǎn)生威脅等特點(diǎn)。目前對(duì)發(fā)酵類中藥消化酶的研究較多，但對(duì)于微生物次生代謝產(chǎn)物及化學(xué)成份轉(zhuǎn)化的研究不夠深入，應(yīng)加強(qiáng)發(fā)酵機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)等方面的深入研究。
4.3 開(kāi)展功效機(jī)制及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究
發(fā)酵類中藥雖然臨床使用非常廣泛，但因物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究不夠深入，質(zhì)量控制指標(biāo)有待進(jìn)一步明確，質(zhì)量控制技術(shù)和方法有待進(jìn)一步提高和完善。建議加強(qiáng)潛在質(zhì)量控制指標(biāo)的研究，從消化酶和化學(xué)成份兩方面入手，在作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，尋找具有發(fā)酵類中藥特色且真正能反映質(zhì)量的控制指標(biāo)。同時(shí)應(yīng)關(guān)注安全性控制指標(biāo)，特別對(duì)因生產(chǎn)過(guò)程控制不規(guī)范導(dǎo)致菌種變化及有毒代謝產(chǎn)物如真菌毒素等的控制。
總之，發(fā)酵類中藥的研究、生產(chǎn)、使用和質(zhì)量管控仍處于較為初級(jí)的階段，因其歷史悠久，臨床價(jià)值高，發(fā)展前景必然廣闊，值得進(jìn)一步在做好傳承的基礎(chǔ)上，做好創(chuàng)新發(fā)展和利用。
來(lái)源：中國(guó)食品藥品監(jiān)管雜志
關(guān)于我們 聯(lián)系我們 營(yíng)業(yè)執(zhí)照 全國(guó)服務(wù)電話：400-818-0021 嘉峪檢測(cè)版權(quán)所有 備案號(hào)：京ICP備14047019號(hào)-2 
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
