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嘉峪檢測網(wǎng) 2022-10-17 12:41
摘要：
基于單克隆抗體藥物的特點，分析了可能影響其臨床有效性和安全性的風(fēng)險因素，包括抗體的結(jié)構(gòu)、靶點特性、藥理作用機制、質(zhì)量控制和臨床擬用患者人群等?；谶@些風(fēng)險因素，結(jié)合審評實踐和國內(nèi)外監(jiān)管機構(gòu)發(fā)布的技術(shù)指導(dǎo)原則，闡述了對單克隆抗體藥物設(shè)計、早期篩選及非臨床研究計劃的一般考慮。圍繞單克隆抗體藥物非臨床審評的關(guān)注重點，即非臨床研究結(jié)果的臨床的相關(guān)性、局限性以及由非臨床向臨床轉(zhuǎn)化時預(yù)測的不確定性進行了探討。
正文：
1975 年，Köhler G 和Milstein C 建立的雜交瘤技術(shù)使規(guī)?；苽涓咛禺愋浴⒕恍缘膯慰寺】贵w( 以下簡稱單抗) 成為可能，由此獲得的單抗在疾病診斷和各種檢測中發(fā)揮了巨大的作用?；谠擁椉夹g(shù)， 1979 年， Schlossman 和其同事發(fā)現(xiàn)了靶向T 細(xì)胞表面抗原并具有清除T 細(xì)胞單抗OKT3( muromonab-CD3) 。經(jīng)過臨床試驗驗證， 1986 年，美國FDA 批準(zhǔn)OKT3 用于器官移植后的急性排斥，這也是FDA 批準(zhǔn)的第一個單抗藥物。但由于鼠源性抗體在人體反復(fù)使用后出現(xiàn)的人抗鼠抗體反應(yīng)，很大程度上限制了其在臨床治療中的應(yīng)用，這也導(dǎo)致2006 年以前僅有寥寥幾個抗體產(chǎn)品批準(zhǔn)上市。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們已可通過抗體工程技術(shù)制備基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、全人源抗體等，治療用抗體藥物已逐漸成為生物技術(shù)藥物開發(fā)的熱點。隨著對抗體的結(jié)構(gòu)和功能的深入了解，新一代更符合臨床治療需求的新型抗體藥物( 如糖工程抗體、Fc 融合蛋白、抗體偶聯(lián)藥物、雙特異抗體、抗體片段等) 不斷出現(xiàn)，抗體治療的疾病種類也在不斷擴大。截至2015 年，F(xiàn)DA 僅批準(zhǔn)了第50 種抗體藥物，然而僅僅6 年多時間，2021 年4 月FDA 便批準(zhǔn)了第100 個抗體dostarlimab，抗體類藥物正式進入了“百”抗時代［1］。這些抗體類藥物主要批準(zhǔn)用于腫瘤、炎癥性疾病、器官移植排斥、偏頭痛和感染性疾病。據(jù)統(tǒng)計，治療用抗體類藥物2018 年全球銷售總額約為1 152 億美元，預(yù)計到2025 年將會達到3 000 億美元［2］。相比發(fā)達國家，我國抗體類藥物的研發(fā)起步較晚，但隨著抗體類藥物研發(fā)的工程技術(shù)開發(fā)、人才隊伍建設(shè)以及投資規(guī)模等方面的不斷發(fā)展，我國抗體類藥物開發(fā)正處于快速發(fā)展的階段，大量從事抗體類藥物創(chuàng)新研發(fā)的公司不斷涌現(xiàn)，抗體類藥物的申報數(shù)量也在逐年增長，雖然仍存在熱門靶點大量集中的現(xiàn)象，但差異化現(xiàn)象已逐漸顯現(xiàn)。為更好地促進我國抗體類藥物產(chǎn)業(yè)科學(xué)健康的發(fā)展，本文參考相關(guān)技術(shù)指南和專業(yè)文獻，初步探討了單抗藥物風(fēng)險因素，闡述了對單抗藥物設(shè)計、早期篩選及非臨床研究計劃的一般考慮，以期為申辦方、研究者以及審評人員提供參考。
一影響抗體藥物有效性和安全性的因素
1．1 抗體類別、亞型、結(jié)構(gòu)以及功能
1.1.1 抗體的類別和結(jié)構(gòu)
抗體的基本結(jié)構(gòu)是由2 個完全相同的重鏈( heavy chain，H) 和2 條完全相同的輕鏈( light chain，L) 通過二硫鍵連接的呈Y形的單體。根據(jù)H 鏈恒定區(qū)抗原性的差異又可將其分為5 類: α 鏈、δ 鏈、ε 鏈、γ 鏈和μ 鏈，抗體也對應(yīng)被認(rèn)為5 類: IgA， IgD， IgE， IgG 和IgM。按照L 鏈的不同，抗體又可分為κ 型和λ 型?？贵w的H 鏈和L 鏈靠近N 端的氨基酸序列變化較大，形成的結(jié)構(gòu)域稱為可變區(qū)( variable region，V 區(qū)) ，靠近C 端的氨基酸序列相對恒定的區(qū)域稱為恒定區(qū)( constant region，C 區(qū)) 。V 區(qū)的H 鏈和L 鏈分別稱為VH和VL，VH和VL各有3 個互補決定區(qū)( complementaritydetermining region，CDＲ) ，可與抗原表位形成互補的空間構(gòu)象。C 區(qū)的H 鏈和L 鏈分別稱為CH和CL。
截至目前所有批準(zhǔn)的治療用抗體都是IgG，標(biāo)準(zhǔn)的IgG 抗體結(jié)構(gòu)由2 個完全相同的抗原結(jié)合片段( Fab) 和1 個可結(jié)晶片段( Fc) 組成。其中Fab 段由L 鏈( 包括VL和CL結(jié)構(gòu)域) 和H 鏈的VH和CH1 結(jié)構(gòu)域組成，可特異性地與單個抗原表位結(jié)合; Fc 段是由1 對H 鏈的CH2，CH3 結(jié)構(gòu)域組成，無抗原結(jié)合活性，但可與Fc 受體( FcＲ) 或補體成分C1q 相互作用而發(fā)揮重要的功能效應(yīng)。2 個Fab 段通過柔性鉸鏈區(qū)與Fc 段相連，這種結(jié)構(gòu)可將結(jié)合的抗原與免疫系統(tǒng)的體液成分和細(xì)胞成分“橋聯(lián)”，在識別抗原的同時，發(fā)揮Fc 段介導(dǎo)的功能效應(yīng)［3］。
1.1.2人FcＲs 及表達特征
在人體中，與IgG 的Fc 段結(jié)合的FcＲs 共有10 種［4 － 5］，包括6 種經(jīng)典的IgG FcＲs( 即FcγＲI /CD64，F(xiàn)cγＲIIA/CD32A，F(xiàn)cγＲIIB/CD32B，F(xiàn)cγＲIIC/CD32C，F(xiàn)cγＲIIIA/CD16A，F(xiàn)cγＲIIIB/CD16B) 、2 種非經(jīng)典的FcＲs( 即FcＲn 和TＲIM21)和2 種FcＲ 樣受體( 即FcＲL4 /CD307d 和FcＲL5 /CD307e) 。這些FcＲs 主要表達于免疫細(xì)胞( 包括血小板) 及一些非免疫細(xì)胞( 如內(nèi)皮細(xì)胞) 表面，并且不同細(xì)胞表達的FcＲs 組合和表達水平各自不同。在血管內(nèi)皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞表面表達的FcＲn，參與IgG 的循環(huán)和間接轉(zhuǎn)運( 從循環(huán)系統(tǒng)進入組織，反之亦然) ，而在胎盤母體一側(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達的FcＲn，可將母體IgG 主動轉(zhuǎn)運到胎兒血液中。除了運輸和循環(huán)IgG 的作用外，F(xiàn)cＲn 還被報道運輸IgG結(jié)合的抗原，促進樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞對抗原的遞呈及隨后的免疫應(yīng)答。FcＲL4和FcＲL5 僅在B 細(xì)胞表達，其中FcＲL5 在多種B 細(xì)胞亞群中表達，而FcＲL4 僅在組織記憶型B 細(xì)胞中表達。TＲIM21 是一種廣泛表達的細(xì)胞內(nèi)受體，但在自身免疫性疾病患者的上皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞表面也有表達。經(jīng)典的FcγＲs 又可分為激活性FcＲs( 包括高親和力的FcγＲI 和低親和力的FcγＲIIA，F(xiàn)cγＲIIC，F(xiàn)cγＲIIIA) 和抑制性FcＲs ( FcγＲIIB) 。激活性FcＲs 可通過胞質(zhì)內(nèi)的免疫受體酪氨酸激活基序( immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAMs) 的磷酸化招募蛋白酪氨酸激酶( protein tyrosinekinase，PTK) 來傳導(dǎo)激活信號，最終會導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的激活、細(xì)胞因子/趨化因子的釋放以及細(xì)胞的遷移。而抑制性FcγＲIIB 通過胞內(nèi)的受體酪氨酸抑制基序( immunoreceptor tyrosine-based inhibitorymotif，ITIMs) 的磷酸化并招募蛋白酪氨酸磷酸酶( protein tyrosine phosphatase，PTP) 從而達到抑制和平衡PTK 參與的激活信號通路。FcγＲI 在單核/巨噬細(xì)胞以及一些樹突狀細(xì)胞中組成性地表達，在炎癥狀態(tài)下在中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面也可誘導(dǎo)表達。FcγＲIIA 在所有的髓樣細(xì)胞以及血小板表面表達，在淋巴細(xì)胞表面無表達。FcγＲIIB 在B 細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面高表達，在單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面也有表達。FcγＲIIC 僅在攜帶FCGＲ2C-OＲF 等位基因的個體( 約占人群的20% ～25%) NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達。FcγＲIIIA 僅在NK 細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞表面表達。FcγＲIIIB 僅在中性粒細(xì)胞有較高表達，在堿性粒細(xì)胞也有少量表達。FcＲs 所觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)不僅取決于其細(xì)胞表面的表達水平和傳遞信號的能力，還取決于其結(jié)合的配體。研究顯示，免疫球蛋白( immunoglobulin，Ig) 與FcＲs 相互作用的親和常數(shù)( KA)范圍為2 × 104 M－ 1 ～ 1 × 1010 M－ 1，可區(qū)分為高親和力FcＲs 和低親和力的FcＲs，高親和力的FcＲs 可與游離/單價Ig 結(jié)合，而低親和力的FcＲs 只能與免疫復(fù)合物、聚合體或調(diào)理形式的Ig 結(jié)合［3 － 7］。
1.1.3抗體Fc 段介導(dǎo)的功能效應(yīng)
Fc 段介導(dǎo)的功能效應(yīng)包括［4 － 5］:
① Fc 介導(dǎo)的細(xì)胞激活，F(xiàn)c 可與激活性FcγＲs 結(jié)合，直接激活表達FcγＲs 的免疫細(xì)胞( 如NK 細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等) ，進而導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放、激活相關(guān)的凋亡，以及主要由NK 細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用( antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) 和由巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用( antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP) ;對于某些共刺激分子( 如4-1BB，CD40 等) 激動型單抗，F(xiàn)c 與FcγIIB 結(jié)合后可誘導(dǎo)靶細(xì)胞表面的靶抗原聚集，進而導(dǎo)致靶細(xì)胞激活和細(xì)胞因子釋放［8］。Fc介導(dǎo)的補體激活和補體依賴性細(xì)胞毒作用( complementdependent cytotoxicity，CDC) ，2 個以上的抗體Fc 段與C1q 結(jié)合后，可導(dǎo)致C1q 發(fā)生構(gòu)型改變，通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)，最終在靶細(xì)胞表面形成攻膜復(fù)合物( membrane attack complex，MAC) ，MAC插入靶細(xì)胞細(xì)胞膜，形成滲漏斑或親水性孔道，進而導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解。
② Fc 介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放，ADCC 和CDC 介導(dǎo)的靶細(xì)胞( 如腫瘤細(xì)胞) 殺傷作用可導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放( 包括腫瘤裂解綜合征) ; 而補體激活過程中形成的過敏毒素C3a 和C5a 又可與免疫細(xì)胞( 如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞) 表面的C3aＲ 和C5aＲ 結(jié)合，進而導(dǎo)致這些免疫細(xì)胞的激活、驅(qū)化、ADCP 和細(xì)胞因子釋放。
1.1.4人IgG 亞型與FcＲs 親和力和Fc 功能活性
人IgGs 又可分為IgG1 ～ IgG4 這4 種亞型，由于Fc 段的不同，不同的IgG 亞型與不同的FcＲs 或C1q 有不同的親和活性，這導(dǎo)致不同亞型的IgGs 體外和體內(nèi)功能活性有明顯不同。IgG1 可與除FcＲL4 之外的所有的IgG FcＲs 結(jié)合; IgG2 可與FcγＲI，F(xiàn)cγＲIIB 和FcＲL4 以外的IgG FcＲs 結(jié)合; IgG3 可與所有IgGFcＲs 結(jié)合; IgG4 可與FcγＲIIIB 以外的所有IgGFcＲs 結(jié)合。IgG1 是治療性單抗最常采用的亞型，可與激活性和抑制性的FcγＲs 結(jié)合，能夠誘導(dǎo)ADCC，ADCP 和CDC; IgG2 的鉸鏈區(qū)相對較短，上鉸鏈區(qū)含有額外的半胱氨酸殘基形成的二硫鍵可影響IgG2的空間構(gòu)象和功能， IgG2 與FcγＲs( 尤其與FcγＲI)的相互作用比IgG1 弱，但IgG2 仍可通過FcγＲIIA引發(fā)單核細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC 以及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ADCP 作用。IgG3 與FcγＲs 的相互作用較強，可引發(fā)ADCC，ADCP 作用，并且引發(fā)CDC 的作用優(yōu)于IgG1，但IgG3 的鉸鏈區(qū)較長( 難以制備和生產(chǎn)) ，其核心鉸鏈區(qū)有11 對二硫鍵，因此對蛋白酶切割不穩(wěn)定，半衰期也較其他亞型相對較短( 可能與FcＲn 的親和力有關(guān)) ，目前尚沒有批準(zhǔn)的IgG3 亞型的單抗。IgG4 的上鉸鏈區(qū)較短，除與高親和力的FcγＲI 有相互作用外，與其余FcγＲs 的相互作用較弱，不會引發(fā)CDC 和NK 細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC 作用，但可引發(fā)ADCP作用。在體內(nèi)， IgG4 分子會經(jīng)歷Fab-arm 交換，從而形成半分子以及雙特異功能單價抗體［3，5，9］。
1.1.5 候選抗體的設(shè)計及工程化改造
由于不同的IgG 亞型的鉸鏈區(qū)及Fc 功能效應(yīng)各有不同，在設(shè)計和篩選候選單抗時，研究者可結(jié)合靶點表達分布情況和擬定作用機制，平衡獲益和風(fēng)險，選擇合適的IgG 亞型或Fc 結(jié)構(gòu)。如果Fc 介導(dǎo)的功能效應(yīng)對有效性并無任何貢獻( 如靶向可溶性靶點或阻斷細(xì)胞表面受體信號傳導(dǎo)的單抗) ，反而出現(xiàn)不期望的風(fēng)險時，研究者可能會選擇Fc 功能效應(yīng)較低的IgG4或采用工程改造使Fc 功能效應(yīng)沉默。例如: 已批準(zhǔn)上市的PD-1 單抗藥物( nivolumab 和pembrolizumab)就采用了功能活性較弱的IgG4［10］，以降低對T 細(xì)胞清除作用。相反，如果Fc 介導(dǎo)的功能效應(yīng)對有效性至關(guān)重要( 如利用ADCC，CDC 作用以清除靶細(xì)胞) ，這時就需要保留Fc 功能效應(yīng)。但這有可能會帶來安全性風(fēng)險，例如: 在非靶細(xì)胞表面也有較高水平的靶抗原表達時，可能會導(dǎo)致這些細(xì)胞/組織的損傷。靶向CD40L 的單抗與血小板表面的FcγＲIIA結(jié)合，可能導(dǎo)致血小板激活和血小板減少癥［11］。在考慮是否保留Fc 功能效應(yīng)或是否進行工程化改造以增加或降低Fc 功能效應(yīng)時，應(yīng)平衡風(fēng)險和獲益，考慮的因素包括:
① 靶抗原在靶細(xì)胞和其他正常/效應(yīng)細(xì)胞中的表達水平是否存在明顯差異。
② 是否可以對Fc 段進行改造，使其保留與有效性相關(guān)的FcγＲ 相互作用位點，從而使與風(fēng)險相關(guān)的FcγＲ 相互作用位點突變沉默。例如: 靶向免疫激活受體( 如CD40，4-1BB) 的激動型抗體，就需要消除IgG1與激活型FcＲs( 包括FcγＲI，F(xiàn)cγＲIIA，F(xiàn)cγＲIIIA) 的結(jié)合活性，保留甚至增強IgG1 或IgG4 與抑制性受體FcγIIB 的親和力［10］。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的不斷進展，研究者對影響抗體功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)( 相互作用界面和糖基化位點及糖型) 的認(rèn)識越來越充分，例如: 添加巖藻糖可降低單抗與自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達的FcγＲIIIa 的親和力，降低ADCC 作用; 添加半乳糖可增強CDC 作用; 唾液酸化在增加肝細(xì)胞對單抗攝取的同時還可降低ADCC 作用［12］。為滿足不同的臨床需求或競爭差異化的需求，基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)和擬定作用機制的工程改造抗體也越來越多［8］，例如:用于濕性年齡相關(guān)性黃斑變性的玻璃體注射藥物雷
珠單抗( ranibizumab，F(xiàn)ab 片段) 和brolucizumab( 單鏈抗體片段) ，通過改變抗體的分子大小，提高了組織滲透力; 抗CD20 抗體obinutuzumab 和抗CCＲ4 單抗mogamulizumab，通過去除Fc 段鹽藻糖修飾增強了ADCC 活性; 第2 代抗CD20 抗體ocaratuzumab通過Fc 段氨基酸替換增強了Fc 與FcγＲIIIA( 包括158V 和158F) 的親和力及ADCC 活性; 抗C5抗體eculizumab 通過跨亞型Fc 段整合( 具有IgG2的118 ～ 260 氨基酸和IgG4 的261 ～ 447 氨基酸)降低了Fc 功能效應(yīng)，PD-L1 單抗atezolizuamb 通過突變糖基化位點( N298A) 去除糖基化消除了Fc 功能效應(yīng)。這些藥物的成功上市，均說明了單抗藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計的重要性。
1．2 藥理作用機制及靶點特性
抗體一般通過3 種機制發(fā)揮作用，即作為拮抗劑、激動劑、通過動員具有細(xì)胞殺傷功能的先天免疫成分的細(xì)胞毒性反應(yīng)發(fā)揮調(diào)理作用或促進細(xì)胞表面受體內(nèi)化和降解。作為阻斷劑可阻斷配/受體的相互作用; 而激動型單抗則是模仿配/受體的相互作用從而啟動有助于清除病原體細(xì)胞的信號級聯(lián)反應(yīng)。具有調(diào)理作用的單抗，可通過其抗原結(jié)合部位與靶點結(jié)合，通過其Fc 段激活補體或與先天免疫細(xì)胞表面的FcγＲs 結(jié)合，通過CDC，ADCC 或ADCP 發(fā)揮細(xì)胞毒性殺傷/吞噬作用。一般抗體會通過以上多種機制組合發(fā)揮作用。
選擇合適的靶點是開發(fā)抗體藥物時需要慎重考慮的重要一環(huán)，除擬用藥理作用機制外，還應(yīng)充分考慮靶蛋白的生物學(xué)功能和表達特征，包括:
① 靶蛋白屬于分泌性介質(zhì)還是細(xì)胞表面受體; 對于細(xì)胞表面受體，還需考慮其在哪些類型的細(xì)胞或在何種細(xì)胞狀態(tài)( 免疫激活/免疫耗竭) 下表達，表達豐度如何，是否可以脫落或內(nèi)化［13］。
② 靶蛋白是否存在基因多態(tài)性或剪接變體，是否與其他蛋白或自身形成二聚體或多聚體。
③ 靶蛋白的生物學(xué)功能，基于文獻或數(shù)據(jù)庫對靶點的生物學(xué)功能/作用( 包括非期望的藥理學(xué)作用) 以及下游的信號通路( 包括與其結(jié)合的配體和受體) 進行全面的分析。這些信息可能來自基因敲除/轉(zhuǎn)基因小鼠模型或其他動物模型的相關(guān)研究信息，也可能來自同靶點藥物的已有臨床/非臨床研究信息，或者存在靶點自發(fā)突變的相關(guān)人群的研究信息。若靶點涉及多條信號通路、生物級聯(lián)效應(yīng)或細(xì)胞因子釋放，當(dāng)可能導(dǎo)致某一無法被生理反饋機制完全控制的生物放大效應(yīng)時，應(yīng)引起高度關(guān)注。
④ 靶蛋白在患者和正常人、疾病組織/微環(huán)境和正常組織/微環(huán)境中的表達差異，例如:對于擬通過細(xì)胞毒性殺傷作用治療腫瘤的單抗，理想的靶點應(yīng)該是僅在腫瘤細(xì)胞表面表達而在正常細(xì)胞中無明顯表達的腫瘤特異性抗原。
1．3 質(zhì)量控制水平
相比小分子藥物，單抗的藥學(xué)質(zhì)量控制水平對其安全性和/或有效性的影響更大。高分子聚合物、宿主細(xì)胞殘留成分、內(nèi)毒素等均可能給臨床帶來安全性風(fēng)險［14］。產(chǎn)品中來自生產(chǎn)細(xì)胞的雜質(zhì)( 尤其是先天免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)雜質(zhì)，如脂多糖、β 葡聚糖、鞭毛蛋白、高遷移率族蛋白和核酸) 以及高水平的單抗聚合物( 多個IgG 分子相互靠近) 可作為危險信號促進DC 細(xì)胞的成熟、激活、蛋白胞吞和遞呈，直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗宿主細(xì)胞蛋白抗體和/或抗藥抗體( anti-drug antibodies，ADA) 。抗宿主細(xì)胞蛋白抗體如果能夠和人體細(xì)胞產(chǎn)生交叉反應(yīng)，則可能導(dǎo)致自身免疫性疾病產(chǎn)生。有些聚合物( 含有重復(fù)結(jié)構(gòu)，能夠直接與BCＲ 結(jié)合) 在沒有T 細(xì)胞的幫助下也可直接激活B 細(xì)胞產(chǎn)生ADA( 主要為IgM) 。此外，單抗聚合物還可通過促進靶受體或FcγＲ 聚集和激活導(dǎo)致放大的或非期望的Fab 和/或Fc 段介導(dǎo)的藥理學(xué)效應(yīng)。單抗產(chǎn)品的來源也是影響免疫原性的重要因素，雖然與嵌合型、人源化或全人源的單克隆抗體
相比，鼠源抗體可引發(fā)人體強烈的免疫應(yīng)答，但值得注意的是，嵌合型、人源化和全人源單克隆抗體也可引發(fā)較高發(fā)生率的免疫原性。單抗中新型序列( 如CDＲs 和其他新型序列) 、突變( 如為增加Fc 功能效應(yīng)、穩(wěn)定性而進行的基因突變，親和力成熟所導(dǎo)致的新獨特型) 、修飾( 如氧化、脫酰胺、醛基化、外源性糖型) 、新型結(jié)構(gòu)( 如融合蛋白、雙特異性或多特異性抗體、單鏈片段、單域抗體) 、連接子或連接區(qū)形成的新表位，理論上都可能被抗原遞呈細(xì)胞處理和遞呈給Th 細(xì)胞，幫助B 細(xì)胞形成ADA。此外，制劑中所采用的輔料( 如人血清蛋白和聚山梨醇酯) 以及容器密閉系統(tǒng)的材料( 包括萃取物和浸出物) 也有可能會與單抗發(fā)生相互作用進而影響產(chǎn)品的質(zhì)量( 導(dǎo)致蛋白聚集、變性或形成加合物) 和免疫原性，進而導(dǎo)致臨床風(fēng)險［15］。
1．4 擬用患者人群
雖然單抗具有較高的選擇性和特異性，但不同適應(yīng)證或者同一適應(yīng)證的不同患者對同一藥物的反應(yīng)往往有很大差異，這提示患者個體間的差異對有效性和安全性有很大的影響?？赡苡绊懹行院桶踩缘幕颊邆€體差異因素包括: 疾病特征( 疾病類型、嚴(yán)重程度、靶蛋白表達水平) 、年齡( 如兒童與成人) 、遺傳學(xué)( 如基因多態(tài)性、基因突變等) 、免疫學(xué)( 如免疫狀態(tài)、免疫能力、預(yù)存抗體水平) 、伴隨治療( 藥物相互作用) 等。
二抗體藥物非臨床研究策略的一般考慮
2．1 預(yù)期目標(biāo)
在制定單抗的非臨床研究計劃時，應(yīng)根據(jù)對上述可能影響產(chǎn)品有效性和安全性的風(fēng)險因素的科學(xué)理解以及臨床擬用情況( 如適應(yīng)證、患者人群、擬定給藥方案等) 合理設(shè)計支持性的非臨床試驗。這些試驗獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)能夠滿足以下評估目的:
① 闡明毒性靶器官、毒性反應(yīng)的劑量/暴露量關(guān)系以及潛在可逆性。
② 確定臨床試驗中需要監(jiān)測的與安全性和有效性相關(guān)的指標(biāo)/生物標(biāo)志物。
③ 可估算人體臨床試驗的起始劑量、遞增劑量以及臨床預(yù)期治療劑量范圍。
④ 能夠初步提示在擬用患者人群中預(yù)期獲益大于風(fēng)險。
2．2 試驗項目及時間安排
與小分子藥物不同，單抗由天然氨基酸組成，分子量較高，僅在細(xì)胞外液中分布，不會進入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，不與DNA 直接發(fā)生相互作用，一般無遺傳毒性風(fēng)險，通常無需開展遺傳毒性試驗。單抗在體內(nèi)可被代謝成為小肽和氨基酸，一般不會產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，因此也無需開展代謝研究。單抗的靶點一般為細(xì)胞外可溶性介質(zhì)或細(xì)胞表面受體，并具有較高的特異性和親和力，因此發(fā)生脫靶毒性的可能性較小，單抗藥物的毒性反應(yīng)主要是放大的藥理學(xué)作用。單抗與hEＲG 通道或其他離子通道的細(xì)胞外/細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用的可能性較低，因此一般不會對心臟的收縮功能產(chǎn)生明顯影響，一般情況下不需要進行心血管系統(tǒng)體外安全藥理學(xué)研究［16 － 18］。單抗所需要開展的非臨床安全性試驗項目可參考ICH S6 ( Ｒ1) 推薦的基本框架，非臨床試驗的實施時間可參考ICH M3 ( Ｒ2) 的指導(dǎo)意見。
2．3 臨床轉(zhuǎn)化思維
單抗的非臨床試驗一般包括采用人體/動物細(xì)胞和組織進行的體外試驗以及采用相關(guān)動物種屬/模型進行的體內(nèi)試驗，這些體外和體內(nèi)試驗都有助于確定單抗的藥理毒理學(xué)特征。由于體外和體內(nèi)、動物和人體、健康人與患者以及患者人群之間存在各種差異，如體外靜態(tài)和體內(nèi)動態(tài)的差異，靶點的結(jié)構(gòu)、分布、表達調(diào)控和生物學(xué)功能的差異，免疫成分的結(jié)構(gòu)、功能和狀態(tài)的差異等，任何一項體外和體內(nèi)試驗都不能完全解決這種差異對臨床轉(zhuǎn)化的影響，各有其優(yōu)缺點，在設(shè)計非臨床試驗時應(yīng)盡可能根據(jù)試驗的目的和試驗影響因素對試驗進行優(yōu)化，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。在對這些非臨床試驗數(shù)據(jù)進行解釋和評估時，應(yīng)考慮與人體的相關(guān)性和局限性，尤其要關(guān)注向人體轉(zhuǎn)化的不確定性。
三有助于風(fēng)險獲益評價的體外試驗
由于抗體具有種屬特異性，關(guān)鍵的體外藥理活性試驗( 如與靶抗原的結(jié)合活性和功能活性試驗等) 應(yīng)同時采用不同種屬( 包括人) 的靶蛋白、細(xì)胞/組織進行評估，定量評價單抗在不同種屬中的相對生物活性和敏感度，以幫助選擇合適的動物種屬用于進一步的體內(nèi)藥理學(xué)和毒理學(xué)試驗，同時也有助于將動物體內(nèi)試驗結(jié)果外推至人體。這些體外試驗可能會發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)試驗所不能預(yù)測的免疫毒性或可阻止臨床試驗開展的非預(yù)期免疫反應(yīng)。在缺乏相關(guān)動物種屬的情況下，這些在人體細(xì)胞/組織中進行的體外試驗對預(yù)測人體有效性和安全性具有重要的價值，也是推算人體首次臨床試驗起始劑量的重要依據(jù)［19］。
3．1 評估Fab 功能效應(yīng)的體外試驗
與Fab 相關(guān)的效應(yīng)包括期望的藥理學(xué)作用和非期望的脫靶作用。評估Fab 功能效應(yīng)的體外試驗包括但不限于: 與靶抗原的親和力試驗、抗原表位表征試驗( 如采用晶體衍射技術(shù)表征抗體互補位-抗原表位的空間構(gòu)象) 、與天然配體的競爭結(jié)合試驗( 拮抗劑應(yīng)與天然配體競爭結(jié)合，而激動劑應(yīng)盡可能避免與天然配體競爭結(jié)合) 、靶點占有率、細(xì)胞水平的功能活性試驗( 如檢測對下游信號的阻斷/激動作用) 等。
3.1.1 on-target 效應(yīng)
應(yīng)評估候選單抗與人和不同動物種屬的靶抗原/靶細(xì)胞的特異性結(jié)合作用。若可獲得靶抗原的重組蛋白，可采用BIAcore，ELISA，KinExA 等方法測定體外結(jié)合力，包括解離常數(shù)( Kd) 以及結(jié)合動力學(xué)參數(shù)( Kon /Koff) 等。基于細(xì)胞結(jié)合的親和力試驗可采用流式細(xì)胞術(shù)測定EC50值。在理想情況下，如果靶點在血液細(xì)胞或其他容易采集的細(xì)胞表面表達，最好能夠采用流式細(xì)胞術(shù)評估人和毒理學(xué)試驗動物細(xì)胞表面天然蛋白與抗體的親和力。此外，也可采用免疫組化( immunohistochemistry，IHC) 技術(shù)評估與人和動物組織的結(jié)合［19］。需要強調(diào)的是，抗體-抗原結(jié)合力高并不意味著更強的功能活性，靶向同一抗原的不同抗體由于結(jié)合的抗原表位不同，可能導(dǎo)致其功能活性有明顯不同。例如: 靶向CD28 的抗體如果結(jié)合部位在天然CD86 結(jié)合部位附近，則傳導(dǎo)共刺激信號; 但與CD28 遠端位點結(jié)合的超級激動抗體即使沒有組織交叉反應(yīng)( tissue cross-reactivity，TCＲ) 識別的第一信號也可直接激活T 細(xì)胞［20］。因此，除評估與靶抗原的結(jié)合活性外，還應(yīng)采用臨床相關(guān)的體外/離體試驗系統(tǒng)評估單抗在人和毒理學(xué)試驗動物中的相對藥理學(xué)活性，如對細(xì)胞的清除、抑制、激活和細(xì)胞因子生成的影響等。在進行這些試驗時，應(yīng)采用梯度稀釋的抗體，以獲得完整的劑量-反應(yīng)曲線，評價指標(biāo)除EC50或IC50外，還應(yīng)關(guān)注Emax，尤其在與同靶點其他藥物進行比較時。試驗中所采用靶抗原表水平/濃度應(yīng)能反映擬用患者人群中實際生理情況。由于體外刺激試驗中所采用的基質(zhì)( 如采用全血或PBS) 對有效濃度范圍的影響較大，在試驗中應(yīng)進行謹(jǐn)慎的對比和分析［19］。除了期望的藥理學(xué)作用外，還應(yīng)采用這些體外試驗測定候選單抗是否有非期望的免疫學(xué)作用，如闡明拮抗劑有無激動作用，受體阻斷劑有無細(xì)胞清除作用等。
3.1.2 脫靶毒性
采用計算機對靶抗原和其他蛋白的序列同源性進行分析，可以初步了解候選單抗的潛在脫靶風(fēng)險。對于同源性較高的蛋白或同一蛋白家族的其他成員，應(yīng)測定候選抗體的脫靶結(jié)合風(fēng)險。
采用IHC 技術(shù)進行的組織交叉反應(yīng)TCＲ 試驗除可用于表征單抗與人體組織/細(xì)胞的交叉反應(yīng)性、為靶點的分布提供有用信息外，也可用于脫靶風(fēng)險的篩選和評估，發(fā)現(xiàn)非預(yù)期的結(jié)合表位。對于單抗藥物，一般采用一系列人體組織進行TCＲ 試驗，這也是首次人體臨床試驗之前所推薦的一系列安全性評估試驗之一。不推薦采用全套動物組織進行TCＲ 試驗，一般僅在人體組織中發(fā)現(xiàn)存在交叉反應(yīng)的情況下，才會采用毒理學(xué)試驗所選的相關(guān)動物組織進行TCＲ 試驗，這主要是為了確證毒理學(xué)試驗所采用的動物組織中是否存在人體組織中類似的交叉反應(yīng)性特征，評估動物試驗結(jié)果與人體的相關(guān)性，解釋動物試驗中發(fā)現(xiàn)的毒性結(jié)果。需要注意的是，在抗體無法到達的區(qū)域( 如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等) 發(fā)現(xiàn)的陽性結(jié)合通常無臨床意義。應(yīng)在藥理學(xué)和安全性評估的全部數(shù)據(jù)背景下對TCＲ 試驗結(jié)果評價和解讀。根據(jù)目前的經(jīng)驗，TCＲ 試驗很少能夠發(fā)現(xiàn)非預(yù)期結(jié)合反應(yīng)( 脫靶風(fēng)險) ，這主要是因為TCＲ 試驗敏感性較差，并不能代表生理條件。在進行TCＲ 試驗時，需要對多種條件進行優(yōu)化，包括陽性對照組織、陰性對照組織、合適的標(biāo)記物或二抗、合適的固定劑和染色程序、受試單抗的濃度范圍等，此外還需要關(guān)注組織樣本的質(zhì)量，通常需要采用HE 染色評估組織形態(tài)，采用IHC 標(biāo)志物( 如抗平滑肌肌動蛋白抗體) 評估組織樣本的完好性。
由于TCＲ 試驗的預(yù)測脫靶毒性的價值較低，因此業(yè)界開發(fā)了很多評估脫靶毒性的替代方法，包括人蛋白微陣列技術(shù)［21］，如Protoarry，HuProt，這種技術(shù)是采用高通量自動化的蛋白表達系統(tǒng)表達和純化帶有標(biāo)記的人蛋白，然后將這些蛋白固定在經(jīng)微細(xì)加工的微陣列表面上( 約包含10 000 ～ 15 000 多種人蛋白) ，以實現(xiàn)高通量地結(jié)合篩選。但這些微陣列技術(shù)的蛋白均不是采用哺乳動物細(xì)胞表達，有一定的缺點:
① 這些蛋白缺少完整的哺乳動物細(xì)胞的糖基化模式。
② 不確定這些蛋白是否以天然構(gòu)象的形式存在。
③ 當(dāng)?shù)鞍c樣到玻璃載玻片上時也可能發(fā)生變性。
最近，越來越多采用人細(xì)胞陣列技術(shù)，例如: Ｒetrogenix 公司采用專有的表達載體陣列，能夠在載玻片的人類細(xì)胞中分別單獨過表達約5 500 多個全長人質(zhì)膜蛋白和分泌蛋白，這些膜蛋白更接近天然構(gòu)象，并且具有哺乳動物細(xì)胞的糖基化模式，與人體生理條件更相關(guān)，假陽性率更低。Integral Molecular 公司的人質(zhì)膜蛋白陣列技術(shù)( MembraneProteome Array) 也是采用的基于細(xì)胞的結(jié)合篩選平臺，建立了可表達5 300 多個全長人質(zhì)膜蛋白的HEK-293T 細(xì)胞庫，采用高通量的流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體與非固定細(xì)胞表達的膜蛋白的結(jié)合活性，對于篩選試驗檢測到的結(jié)合靶點，還可以通過梯度稀釋后分析稀釋結(jié)合曲線進一步確證是否屬于特異性結(jié)合。由于采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)，因此該技術(shù)平臺的效率和敏感性更高。不足的是這一平臺技術(shù)不能檢測抗體與分泌蛋白的脫靶結(jié)合作用。
3．2 評估Fc 段功能效應(yīng)的體外試驗
一系列的體外試驗可用于評估Fc 段的功能效應(yīng)，如與人FcγＲs 親和力研究以及細(xì)胞水平的ADCC，CDC和ADCP 試驗等。對Fc 功能試驗的要求很大程度上取決于所選擇的IgG 亞型、工程化改造目的以及擬定的作用機制。
對于ADCC 和ADCP 試驗，靶細(xì)胞的選擇主要取決于單抗的靶點表達情況，可采用人原代細(xì)胞，也可以采用表達靶蛋白的細(xì)胞系。對于ADCC 試驗，免疫效應(yīng)細(xì)胞一般為人原代NK 細(xì)胞或采用IL-2 激活、并表達高水平的FcγＲIII A 的NK 細(xì)胞系( 如NK-92 細(xì)胞) 。靶細(xì)胞誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞激活可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測( 細(xì)胞激活標(biāo)志物CD69 和CD107a增加) 。此外，也可以采用轉(zhuǎn)染表達人FcγＲIII A 和報告基因［攜帶熒光素酶( luciferase) 的NFAT 啟動子結(jié)構(gòu)］的Jurkat 細(xì)胞來評估效應(yīng)細(xì)胞的激活程度［19， 22 － 23］。除了采用報告基因法評估效應(yīng)細(xì)胞的激活外，還可以采用LDH 釋放法、熒光素鈣染色法、CFSE 染色法或者51Cr 釋放法評估對靶細(xì)胞的殺傷活性。ADCP 試驗的效應(yīng)細(xì)胞一般采用原代細(xì)胞( 全血或PBMC) ，也可采用表達高親和力的FcγＲIIIA 并轉(zhuǎn)染報告基因的Jurkat 細(xì)胞或體外傳代的巨噬細(xì)胞，通過熒光標(biāo)記的靶細(xì)胞數(shù)量下降或采用流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞絕對數(shù)量的下降來評估吞噬作用。由于在體內(nèi)發(fā)揮ADCP 作用的主要是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，體外ADCP 試驗并不能反映體內(nèi)的復(fù)雜情況，因此這些體外試驗只能用于定性ADCP 作用，而不能定量轉(zhuǎn)化到人體。
對于CDC 作用的評估，可直接評估C1q 與Fc的親和力。但更常用的做法是采用表達目標(biāo)靶抗原的細(xì)胞系或原代細(xì)胞與人補體及不同濃度的單抗共孵育，采用ADCC 試驗中類似的方法檢測靶細(xì)胞的毒性。
可基于這些Fc 功能效應(yīng)體外試驗( ADCP 除外) ，采用最低預(yù)期生物效應(yīng)劑量水平( minimum anticipatedbiological effect level，MABEL) 法計算人體起始劑量，但前提是所采用的靶細(xì)胞的靶抗原的密度/表達水平要與擬用患者人群中體內(nèi)靶細(xì)胞的抗原表達水平一致/相當(dāng)，這樣才可以基于體外試驗中EC50值計算MABEL。此外，如果在同一試驗條件下，發(fā)現(xiàn)受試抗體引發(fā)的細(xì)胞和補體激活效應(yīng)遠遠高于陽性對照［如阿侖單抗( alemtuzumab) 、利妥昔單抗( rituximab) ］，應(yīng)需謹(jǐn)慎考慮，即使這些增強的反應(yīng)是所期望的或者可能增加有效性。
3．3 體外細(xì)胞因子釋放試驗( cytokine release assay，CＲA)
首先需要明確CＲA 主要是用來發(fā)現(xiàn)風(fēng)險/危害，而不是對人體風(fēng)險進行定量評估。對于作用機制涉及細(xì)胞因子釋放的單抗，CＲA 可用于作用機制研究，也可用于候選抗體的篩選［19， 24 － 25］。治療性單抗可能通過Fab 介導(dǎo)的免疫細(xì)胞表面靶受體聚集/激活和/或Fc 介導(dǎo)的與NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞FcγＲs 相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放，在人體中導(dǎo)致形成細(xì)胞因子釋放綜合征( cytokine releasesyndrome，CＲS) 。這些細(xì)胞因子可能來自靶細(xì)胞，也可能來自效應(yīng)細(xì)胞。在開發(fā)候選抗體藥物時，應(yīng)對靶點的生物學(xué)作用及作用機制的已有信息進行綜合分析，設(shè)計并篩選合適的候選抗體結(jié)構(gòu)，并考慮是否需要進行CＲA。由于CＲS 有可能給人體帶來嚴(yán)重的危害甚至導(dǎo)致死亡，因此即使作用機制不涉及細(xì)胞因子釋放，在以下情況下都應(yīng)進行體外CＲA，以識別臨床可能出現(xiàn)的CＲS 風(fēng)險［19］:
① 單抗可與免疫細(xì)胞或其他能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子/趨化因子的細(xì)胞( 如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等) 表面的靶點或FcγＲs 結(jié)合。
② 抗體與FcγＲs 有很強的交聯(lián)能力，即使靶細(xì)胞不表達細(xì)胞因子。
③ 對于靶向可溶性靶點的單抗，通常不要進行CＲA。但也有例外的情況，例如: 有比較強的證據(jù)提示有免疫復(fù)合物的形成( 如靶點為多聚體蛋白) ，或靶抗原在免疫細(xì)胞表面存在膜蛋白形式的剪接體( 如IL-6) ，這時就需要進行CＲA。
④ 2 個臨床經(jīng)驗有限的單抗聯(lián)合使用，即使單個抗體已闡明無誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放的潛力。值得注意的是，體外CＲA 并不能預(yù)測大量細(xì)胞凋亡/壞死導(dǎo)致的細(xì)胞因子釋放( 如腫瘤裂解綜合征) 。
目前業(yè)界已開發(fā)了多種CＲA 檢測平臺，不同的研究者采用的方法也多種多樣，所選擇的受試抗體呈現(xiàn)形式、細(xì)胞類型、陽性對照抗體、細(xì)胞因子檢測方法和檢測時間點等均各有不同。受試抗體的呈現(xiàn)形式主要包括可溶性形式( 液相) 、濕法或干法直接包被( 固相) 、抗Fc 抗體捕獲固定或與免疫細(xì)胞和靶細(xì)胞共培養(yǎng)，其中可溶性形式和干法直接包被占大多數(shù)。受試細(xì)胞包括全血細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞( peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 、PBMC與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)等［25 － 26］。目前，國內(nèi)外尚無專門針對CＲA 的技術(shù)指導(dǎo)原則，也無標(biāo)準(zhǔn)的試驗方法，應(yīng)基于受試抗體的靶點、涉及的細(xì)胞群和可能的作用機制選擇并優(yōu)化CＲA 方法。在選定CＲA 方法后，需了解這種方法出現(xiàn)假陽性和假陰性概率，而這很大程度上取決于所選擇的陽性對照和陰性對照。為降低因細(xì)胞因子分析檢測時間點錯誤所導(dǎo)致的假陰性風(fēng)險，應(yīng)首先采用不同的供者細(xì)胞評估細(xì)胞因子釋放的動力學(xué)特征，研究中應(yīng)伴隨陽性對照，陽性對照最好能夠反映可能的/所期望的細(xì)胞因子釋放機制。如果作用機制涉及FcγＲs 參與，應(yīng)采用包含所有表達FcγＲs 的細(xì)胞( 包括中性粒細(xì)胞和血小板) 和補體的全血細(xì)胞，并以阿倫單抗( Campath)作為陽性對照［27］。而對于直接靶向T 細(xì)胞和作用機制可能涉及靶點聚集的抗體，基于PBMC 的CＲA可能更加敏感，muromonab ( 靶向CD3 的單抗) /TGN1412 更適合作為陽性對照［28］。如果靶點僅在組織中或疾病狀態(tài)下表達( 如腫瘤細(xì)胞、激活的效應(yīng)細(xì)胞或自身致病性細(xì)胞) ，或者所涉及的細(xì)胞在全血/PBMC 中并不存在，在CＲA 試驗中可能采用細(xì)胞系或原代細(xì)胞( 如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或過表達激活所需靶點的細(xì)胞) 以模擬體內(nèi)的疾病狀態(tài)。如果同時存在細(xì)胞因子釋放和血小板激活/聚集的風(fēng)險( 如單抗可與血細(xì)胞板細(xì)胞表面受體結(jié)合，或ADA 形成的免疫復(fù)合物可與血小板表面的FcγＲ IIA 結(jié)合) ，這時就需要考慮FcγＲ IIA 基因多態(tài)性( 包括FcγＲ IIA 131 H/H，F(xiàn)cγＲ IIA 131 H/Ｒ和FcγＲ IIA 131 Ｒ /Ｒ 這3 種剪接變體) 對反應(yīng)的影響，因此應(yīng)采用包含不同F(xiàn)cγＲ IIA 變體的供者細(xì)胞進行試驗［19］。所選擇檢測細(xì)胞因子應(yīng)與特定的作用機制和所擔(dān)憂的安全性高度相關(guān)，由于IL-6， IL-8， IFN-γ 和TNF-α 常與臨床細(xì)胞因子釋放有關(guān)，因此建議常規(guī)檢測。其他可檢測的細(xì)胞因子還包括IL-1β， IL-2， IL-5， IL-10， IL-12 和IL-17［29］。目前，有多種方法可用于細(xì)胞因子定量檢測，其中最常用的是多重細(xì)胞因子檢測，這種方法可以從少量的血清或血漿樣品中檢測評估大量的細(xì)胞因子。若有可能，藥物濃度應(yīng)在預(yù)測的人體有效藥物濃度范圍內(nèi)，但由于體外靜態(tài)系統(tǒng)難以反映藥物在體內(nèi)的動態(tài)特征，如組織分布、代謝和長期暴露等。為研究給藥后所導(dǎo)致的急性反應(yīng)，可基于人體擬用劑量下的Cmax選擇體外CＲA 中的受試物濃度［19］。
對體外CＲA 的結(jié)果解釋需要考慮多方面的內(nèi)容包括: 擬用的患者人群、靶點的生物學(xué)特性、作用機制及新穎程度( 對于沒有臨床經(jīng)驗的first in class產(chǎn)品需特別謹(jǐn)慎) ，細(xì)胞因子釋放屬于預(yù)期藥理學(xué)作用還是非期望的不良反應(yīng)，細(xì)胞因子的來源，例如: 來自T 細(xì)胞的IL-2 可導(dǎo)致效應(yīng)記憶T 細(xì)胞快速擴增，需要引起高度注意。這與從NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中來源的細(xì)胞因子是不同的; 不同供體間的反應(yīng)頻率與基因多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)合體外CＲA 的結(jié)果以及已有的藥理毒理學(xué)數(shù)據(jù)，基于證據(jù)權(quán)重分析方法，項目團隊可能做出的決策包括:
① 在確定給藥途徑、給藥劑量、給藥速率、給藥頻率給予相應(yīng)的考慮。
② 對藥物進行改造，改變藥物的結(jié)構(gòu)。例如: 采用單價抗體結(jié)構(gòu)以避免靶點的交聯(lián)和聚集，采用工程方法使Fc 功能沉默等。
③ 排除風(fēng)險增加的人群。
④ 制定風(fēng)險控制計劃，加強給藥后監(jiān)測，制定明確的緊急干預(yù)措施，如給予類固醇皮質(zhì)激素、細(xì)胞因子/受體阻斷劑等。
⑤ 結(jié)合擬用患者疾病的嚴(yán)重程度，預(yù)期的風(fēng)險獲益比，風(fēng)險的可監(jiān)測、可控制和可接受程度，已有的替代治療方法及可及性等，綜合考慮是否繼續(xù)開發(fā)。
四小結(jié)
與小分子藥物不同，單抗的毒性反應(yīng)主要是放大的藥理學(xué)作用，其有效性、安全性和藥代特征與其類別、結(jié)構(gòu)、靶點特性、作用機制密切相關(guān)。在早期篩選設(shè)計候選抗體時，應(yīng)綜合考慮當(dāng)前對疾病病理學(xué)機制、靶點表達分布和功能特性的認(rèn)識以及預(yù)期的作用機制，選擇合適的IgG 亞型或Fc 結(jié)構(gòu)，甚至可能需要進行工程改造以去除對有效性無任何貢獻的功能或者增強擬用的功能活性。在制定非臨床計劃時，應(yīng)基于對風(fēng)險因素的理解及臨床擬用情況合理設(shè)計非臨床試驗。在對非臨床研究結(jié)果進行評價時需關(guān)注人體轉(zhuǎn)化的相關(guān)性和局限性，尤其要關(guān)注因體外/體內(nèi)、動物/人體、健康人/患者之間靶點表達及功能活性差異所導(dǎo)致的非臨床研究結(jié)果外推至人體的不確定性。在推算首次人體臨床試驗起始劑量時，應(yīng)綜合考慮所有的體外體內(nèi)的藥理學(xué)、藥動學(xué)及毒理學(xué)試驗數(shù)據(jù)，盡可能建立完整的劑量/暴露量/靶點占有率-反應(yīng)曲線關(guān)系，以確保所選擇的起始劑量能夠出現(xiàn)預(yù)期的藥理學(xué)作用，且在安全劑量范圍內(nèi)，隨后劑量遞增時應(yīng)基于新獲得的人體數(shù)據(jù)對建立的藥動學(xué)/藥效學(xué)模型不斷修正［30］。
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