中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

本文主要介紹了北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

一、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產(chǎn)品主要組成成分 

產(chǎn)品主要組成成分見下表：

二、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產(chǎn)品預(yù)期用途

本試劑盒用于體外定性檢測(cè)人外周血血漿中 Septin9、SDC2、BCAT1 基因的甲基化。

病人外周血中甲基化的 Septin9、SDC2、BCAT1 基因可以通過 DNA 的特異擴(kuò)增而被檢測(cè)到。本試劑盒適用于臨床醫(yī)師建議做腸鏡檢測(cè)，但因病人依從性差或其它醫(yī)學(xué)原因無法做腸鏡檢測(cè)患者的輔助診斷，不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)，不能用于普通人群的腫瘤篩查。本產(chǎn)品僅作為原發(fā)性結(jié)直腸癌的輔助診斷供臨床醫(yī)師參考。

Septin9（胞裂蛋白 9）是高度保守的三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白septin 家族成員之一，廣泛存在于人體細(xì)胞，具有重要的腫瘤抑制作用，其甲基化被證實(shí)與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。SDC2（多配體蛋白聚糖-2）在結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，可以通過多種途徑抑制腫瘤形成。BCAT1（支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶 1）為原癌基因 MYC 直接調(diào)控的下游靶基因之一，其表觀遺傳沉默可導(dǎo)致 Wnt 信號(hào)激活，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血漿樣本中 Septin9、SDC2 及 BCAT1 三基因啟動(dòng)子區(qū)域呈高度甲基化。甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而影響基因的正常表達(dá)，并使其抑癌功能喪失。

三、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產(chǎn)品包裝規(guī)格

30 人份/盒。

四、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

提取血漿中的游離 DNA，然后用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化未發(fā)生甲基化的胞嘧啶，通過脫氨基反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶磺酸鹽，發(fā)生甲基化的胞嘧啶則不會(huì)被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的 DNA（BisDNA）做多重 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)中的引物、探針能區(qū)分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優(yōu)先得到擴(kuò)增，與甲基化 Septin9、SDC2、BCAT1 基因序列特異性結(jié)合的熒光素探針可以在 PCR 反應(yīng)中專一地檢測(cè)出甲基化序列。內(nèi)參對(duì)照 ACTB（β-actin）基因用于評(píng)估檢測(cè)中 DNA 量是否足夠。

五、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的主要原材料的選擇

本產(chǎn)品的主要原材料包括引物干粉、PCR反應(yīng)液、人類基因組DNA和Hela細(xì)胞基因組DNA。這些原料均是通過外購(gòu)的方式獲得。

其中引物的序列均由艾克倫醫(yī)療自行設(shè)計(jì)，由合成公司經(jīng)過合成、修飾、純化方式獲得；PCR反應(yīng)液由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得；人類基因組DNA和Hela細(xì)胞基因組DNA由供應(yīng)商提取純化獲得。

艾克倫醫(yī)療對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

六、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的企業(yè)參考品設(shè)置情況

本產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測(cè)限參考品，組成如下：

陽(yáng)性參考品包括3種，由一定DNA濃度下，Septin9、SDC2、BCAT1三基因不同甲基化比例樣本組成。

陰性參考品包括3種，其中兩種為不同DNA濃度下，Septin9、 SDC2、BCAT1均無甲基化的參考品，一種為三基因均甲基化但

甲基化比例低于檢測(cè)限的陰性參考品。

精密度參考品包括2種，為一定DNA濃度下，Septin9、SDC2、BCAT1三基因均甲基化，但甲基化程度高低不同的精密度參考

品。

檢測(cè)限參考品包括1種，為一定DNA濃度下，Septin9、SDC2、BCAT1三基因甲基化略高于檢測(cè)限水平的參考品。

七、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

艾克倫醫(yī)療對(duì)試劑盒反應(yīng)體系的研究中包括引物探針濃度的確定、PCR反應(yīng)液的選擇、陰/陽(yáng)性質(zhì)控品配方的確定等；對(duì)PCR

過程中的退火溫度進(jìn)行研究；完成樣本的用量以及樣本保存時(shí)間的研 究 ； 對(duì) 該 產(chǎn) 品 三 種 適 用 機(jī) 型 宏 石 PCR 分 析 系 統(tǒng)

SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480的反應(yīng)程序及分析條件進(jìn)行了研究。

通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。艾克倫醫(yī)療根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最

佳的生產(chǎn)工藝。

八、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的分析性能評(píng)估探究

本產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括：準(zhǔn)確性（陽(yáng)性符合率、陰性符合率）、精密度、檢測(cè)限、分析特異性的評(píng)估；核酸提取試劑的性能評(píng)估；三種適用的 PCR 儀機(jī)型（宏石 PCR 分析系統(tǒng)SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480）評(píng)估。

準(zhǔn)確性研究分別使用三個(gè)批次的試劑盒對(duì)企業(yè)陰/陽(yáng)性參考品及臨床樣本來源的結(jié)直腸癌陰/陽(yáng)性樣本池在三種適用機(jī)型上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性符合率 100%、陰性符合率 100%。 將三個(gè)基因的甲基化模板 DNA 混合成 DNA 不同濃度和不同甲基化水平的樣本，使用試劑盒在三種適用機(jī)型上對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性為 100%。將臨床結(jié)直腸癌樣本來源的 DNA，配制成不同甲基化比例的 Septin9、SDC2、BCAT1 單基因甲基化樣本，在三種適用機(jī)型上對(duì)試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行研究，準(zhǔn)確性為100%。

精密度的研究使用了兩種不同的樣本。第一種樣本是精密度參考品，使用三批次試劑盒分別在三種適用的儀器上進(jìn)行檢測(cè)。第二種樣本是臨床樣本混合的陰性樣本池和陽(yáng)性樣本池樣品，對(duì)三批試劑盒的批次內(nèi)/間、日內(nèi)/日間（20 天）、操作者間及不同實(shí)驗(yàn)室間的精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究結(jié)果顯示 Septin9、SDC2、BCAT1 和 ACTB 基因 Ct 值的變異系數(shù)均小于 10%。檢測(cè)限研究，以陰性血漿樣本為基質(zhì)，對(duì)不同游離 DNA 濃度下含有不同比例甲基化 DNA 的血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定血漿樣本的檢測(cè)限，并在三種適用機(jī)型上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明在血漿 DNA 濃度為 0.02ng/µL 時(shí)，試劑盒檢測(cè) P 值為陽(yáng)性的檢測(cè)限為 0.2%三基因甲基化，0.5%的 Septin9 基因甲基化、2%的 SDC2基因甲基化和 0.5%的 BCAT1 基因甲基化。特異性研究的擴(kuò)增產(chǎn)物SNP分析顯示人群中的SNP位點(diǎn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無影響。交叉反應(yīng)研究顯示，檢測(cè)試劑對(duì)于發(fā)生腸轉(zhuǎn)移的其它原發(fā)癌癥（包括子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌）檢出率較低，特異性均超過 80%，說明產(chǎn)品僅適用于原發(fā)性結(jié)直腸癌的檢測(cè)。檢測(cè)其它癌癥包括胃癌、食管癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌的特異性均超過 80%。檢測(cè)自身免疫性疾病包括紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特異性均超過 90%。檢測(cè)其它腸道良性疾病包括腸腺瘤、腸息肉和腸炎樣本的特異性超過 85%。在有其它基因（SHOX2 和/或 RASSF1A）甲基化的肺癌樣本中，檢測(cè)的特異性超過 90%。

干擾實(shí)驗(yàn)顯示，樣本中含有以下干擾物：未甲基化 DNA（150ng/ml）、膽紅素（0.20mg/ml）、血紅蛋白（10mg/ml）、甘油三酯（12mg/ml）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml）、紅細(xì)胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/ml）、膽固醇（5mg/ml）、尿酸（0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml），對(duì)檢測(cè)結(jié)果無影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮(zhèn)痛藥等在最大使用劑量范圍內(nèi)，不影響試劑盒對(duì)樣本檢測(cè)的 Ct 值及 P 值判定。

對(duì)與試劑盒配套使用的血漿樣本處理試劑（核酸提取試劑，京昌械備 20180004 號(hào)，北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行了性能評(píng)估，結(jié)果表明其與市場(chǎng)常用的核酸提取轉(zhuǎn)化試劑（Qiagen游離核酸提取和快速亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒）在 DNA 提取效率、重復(fù)性及抗干擾能力性能相當(dāng)。試劑盒對(duì)于臨床樣本游離DNA 的提取效率為 85.16%，提取轉(zhuǎn)化均符合進(jìn)一步 PCR 檢測(cè)的要求。采用精密度研究中相同樣本進(jìn)行了配套使用的血漿樣本處理試劑的提取精密度研究，結(jié)果表明在核酸提取過程中DNA 提取量、P 值的變異系數(shù)小于 10%。

對(duì)該產(chǎn)品適用的三種儀器宏石 PCR 分析系統(tǒng) SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480 進(jìn)行了性能評(píng)估，結(jié)果顯示在三種適用機(jī)型上的陰/陽(yáng)性符合率、檢測(cè)限、精密度均符合質(zhì)量要求，可以作為該產(chǎn)品的適用機(jī)型。

九、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的陽(yáng)性判斷值研究

艾克倫醫(yī)療采用三基因擬合 P 值公式法確定陽(yáng)性判斷值。每個(gè)樣本進(jìn)行 3 次 PCR 平行測(cè)試，計(jì)算 Septin9、SDC2、BCAT1 和ACTB 基因 3 個(gè)復(fù)孔平均 Ct 值，其中各個(gè)基因無擴(kuò)增時(shí)，Ct值定義為 45.0。ACTB 基因的 Ct 值≤35.0 時(shí)，樣本檢測(cè)結(jié)果有效。在確定樣本檢測(cè)結(jié)果有效的情況下，樣本 P 值≥1.2 則判斷樣本為陽(yáng)性，樣本 P 值＜1.2 則判斷樣本為陰性。陽(yáng)性判斷值研究入組（訓(xùn)練集和驗(yàn)證集）有效樣本數(shù)共計(jì)513 例樣本，包括正常樣本 237 例、結(jié)直腸癌病人樣本 146 例、其它干擾樣本（包括腸腺瘤、腸息肉、腸炎、胃癌、食管癌和肝癌）130 例。樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行多種方法統(tǒng)計(jì)分析，包括 1/3 次PCR 反應(yīng) Ct 值、2/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、3/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、3 次 PCR 反應(yīng)平均 Ct 值、單基因、兩基因、三基因、三基因組合擬合公式等，比較不同分析方法的檢測(cè)靈敏度、特異性、總符合率，最終確定使用三基因擬合 P 值公式法檢測(cè)準(zhǔn)確率最高。并使用測(cè)試集樣本再次驗(yàn)證三基因擬合公式和其它陽(yáng)性判斷值方法，測(cè)試集研究入組有效例數(shù) 350 例樣本，包括腸道正常樣本 119 例、結(jié)直腸癌病人樣本 106 例、其它干擾樣本（包括腸腺瘤、腸息肉、腸炎、胃癌、食管癌和肝癌）125 例進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明三基因擬合 P 值公式法特異性為 94.67%，靈敏度為90.57%，總符合率為 93.43%。

十、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法）的穩(wěn)定性研究

艾克倫醫(yī)療對(duì)該產(chǎn)品的穩(wěn)定性的研究包括長(zhǎng)期穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性（包括開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性）及樣本穩(wěn)定

性（包括全血、血漿及 BisDNA 的穩(wěn)定性）。長(zhǎng)期穩(wěn)定性：選擇三批次試劑盒置于-20±5℃冰箱中保存，在儲(chǔ)存后的第 0、3、6、9、12、13 個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示產(chǎn)品在生產(chǎn)后 13 個(gè)月的產(chǎn)品性能符合技術(shù)要求，試劑性能穩(wěn)定。確定產(chǎn)品有效期可達(dá) 12 個(gè)月。

使用穩(wěn)定性：將三批試劑盒置于-20±5℃開瓶放置，分別于第 2 周、4 周和 6 周后，檢測(cè)其外觀、準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度等指標(biāo)，穩(wěn)定性結(jié)果 P 值及 CV 值均無顯著差異，無顯著變化趨勢(shì)，其產(chǎn)品的主要性能均符合技術(shù)要求。將三批次試劑盒在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下，取出試劑盒反復(fù)凍融 6 次，檢測(cè)每次凍融后的試劑盒的性能均符合技術(shù)要求。將三批試劑盒置于 37℃，分別于 1 天、2 天、3 天后檢測(cè)產(chǎn)品性能，均符合技術(shù)要求。

艾克倫醫(yī)療對(duì)全血樣本、血漿樣本及 BisDNA 的樣本穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明使用 EDTA 抗凝管（BDVacutainer®，6mL，國(guó)械注進(jìn) 20152222083）采集全血，建議選用 2～8℃放置 4 小時(shí)以內(nèi)的新鮮血樣分離血漿后用于檢測(cè)；使用康為游離DNA 采血管（康為世紀(jì)，5mL，蘇械注準(zhǔn) 20192220059）采集全血，建議選用室溫放置 4 天以內(nèi)的血樣分離血漿后用于檢測(cè)；使用 Streck Cell free 采血管（DNA Cell-Free DNA BCT®BLOOD COLLECTION TUBE，貨號(hào) 218962）采集全血，建議選用室溫放置 6 天以內(nèi)的血樣分離血漿后用于檢測(cè)。分離后的血漿樣本建議在-20±5℃保存 30 天以內(nèi)，在 2～8℃保存 12 小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；BisDNA 保存期限為在-20±5℃保存 4 天以內(nèi)，在 2~8℃保存 16 小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。血漿樣本和 BisDNA 樣本僅可凍融一次。