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依那普利是臨床上常用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，用于各種原發(fā)性高血壓、腎性高血壓、充血性心力衰竭。原料藥主要以馬來酸依那普利的形式存在，原料存在的主要雜質(zhì)為依那普利拉（雜質(zhì)Ⅰ）和依那普利雙酮（雜質(zhì)Ⅱ），其中主要是雜質(zhì)Ⅰ。

 

本文擬以歐洲藥典的方法為基礎(chǔ)，對其進行色譜條件優(yōu)化，進行雜質(zhì)定量測定方法的驗證，以期為雜質(zhì)Ⅰ提供可靠的定量檢測方法，同時為該類方法的驗證提供更加科學(xué)全面的驗證參數(shù)。

 

1　儀器和試藥

 

1.1　儀器

 

XP205DR電子天平；2臺島津LC20A液相色譜儀；Mili-QIntegrals超純水系統(tǒng)；酸度計；KQ-300DV型數(shù)控超聲波清洗儀。

 

1.2　試劑和試藥

 

對照品：馬來酸依那普利（批號100705-201604，含量99.9%）、依那普利拉（雜質(zhì)Ⅰ）（批號2016-784，含量88.1%）。

樣品：馬來酸依那普利原料（批號5113-6-015）。

 

試劑：磷酸（分析純，批號20171026）；磷酸二氫鉀（分析純，批號20161208；乙腈（色譜級，批號171011）；甲醇（色譜級，批號163201）。

 

2　流動相及其他溶液的配制

 

2.1　流動相及溶劑

 

緩沖液：稱取磷酸二氫鉀5.4g，加水制成1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0；溶劑1：緩沖液-乙腈-甲醇（1∶2∶2）；溶劑2：溶劑1-緩沖液（8∶92）；流動相A：溶劑1-緩沖液（1∶9）；流動相B：乙腈。

 

2.2　供試品儲備液

 

精密稱取馬來酸依那普利原料適量，置50mL量瓶中，加甲醇10mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成20mg·mL-1的供試品儲備液。

 

2.3　對照品溶液

 

精密稱取依那普利拉對照品適量，置20mL量瓶中，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成1mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液1、2和3mL至100mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為10、20和30μg·mL-1的對照品溶液。

 

2.4　混合對照品溶液

 

精密稱取馬來酸依那普利對照品和依那普利拉對照品至10mL量瓶中，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度。精密量取1mL至100mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，制成20μg·mL-1的混合對照品溶液。

 

3 色譜條件及測定方法

 

3.1　色譜條件

 

采用ShiseidoC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫65℃，進樣器溫度4℃，進樣量20μL，流動相同“2.1”項，梯度洗脫，洗脫順序見表1，流速1mL·min-1，檢測波長210nm。

 

 

3.2　測定法

 

精密稱取馬來酸依那普利適量，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成每1mL中約含2mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取依那普利拉對照品適量，精密稱定，加甲醇6mL，加溶劑2制成每1mL約含6μg·mL-1的對照品溶液，同法測定，按外標(biāo)法計算含量，依那普利拉的含量不大于0.3%。

 

4　統(tǒng)計分析軟件

 

本文所用統(tǒng)計軟件包括JMP和理化方法驗證統(tǒng)計軟件（PCMV）。

 

5　方法驗證及結(jié)果

 

5.1　系統(tǒng)適用性試驗

 

取“2.4”項下的混合對照品溶液，按照“3.1”的色譜條件進樣，獲得的色譜圖見圖1，出峰順序為馬來酸、依那普利拉和依那普利。依那普利峰的拖尾因子為1.0<2.0，馬來酸與依那普利拉分離度19.0>1.5，依那普利拉與依那普利分離度為30.9>4.0，依那普利拉理論塔板數(shù)不低于5000。

 

 

5.2　專屬性

 

取“2.4”項下的混合對照品溶液，按照“3.1”的色譜條件，進樣，獲得的色譜圖如圖1所示，馬來酸與依那普利拉分離度19.0>1.5，依那普利拉與依那普利分離度為30.9>4.0，方法的專屬性良好。

 

5.3　線性、檢測下限與定量下限和范圍

 

5.3.1　實驗設(shè)計

 

在濃度范圍為其質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)（0.3%）的8.0%（預(yù)實驗確定的LOD）~200.0%內(nèi)設(shè)置9個濃度點，0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1，每個濃度獨立制備3份。

 

5.3.2　操作步驟

 

精密量取“2.3”項下10μg·mL-1的對照品溶液0.5、1和2mL，20μg·mL-1的對照品溶液2、4、5mL，30μg·mL-1的對照品溶液1、2和4mL，分別置10mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，制成約0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1的對照品溶液，每個濃度獨立制備3份，進樣測定，試驗結(jié)果見表2。

 

 

5.3.3　線性數(shù)據(jù)分析

 

線性方程：以濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得濃度-峰面積的最小二乘回歸圖，見圖2。線性方程：Y=139.86+38982.17X　r=0.9998截距估計值：截距為-139.86，截距的標(biāo)準(zhǔn)誤為867.04，t比為-0.16，概率>|t|值為0.87>0.5，統(tǒng)計上顯示截距與0沒有顯著性差異，由此確定依那普利拉雜質(zhì)可通過外標(biāo)法確定其含量?；貧w線的標(biāo)準(zhǔn)誤為2695.87。

 

 

5.3.4　檢測下限與定量下限

 

基于“5.3.3”項的回歸方程，采用線性 95% 的預(yù)測區(qū)間確定分析方法的檢測下限與定量下限分為：

 

 

5.3.5　線性范圍

 

該分析方法在0.5~12.0μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)均滿足線性要求。

 

5.4　準(zhǔn)確度和精密度

 

5.4.1　實驗設(shè)計

 

（1）對影響此方法的因素進行風(fēng)險分析，確定本方法的主要影響因素：儀器、分析人員以及每個分析人員的獨立操作次數(shù)（時間）；

 

（2）通過預(yù)實驗，確定偏倚約為10%，變異約為5%，將α設(shè)為5%，效能設(shè)為90%時，通過JMP軟件求得所需的樣本量，即實驗次數(shù)不少于5次；

 

（3）以上述2個條件為基礎(chǔ)，將3個主要因素均設(shè)置2個水平，采用3因素全析因設(shè)計，確定8個實驗條件（見表4），滿足參數(shù)計算的樣本量需求；

 

（4）濃度范圍選擇：以加標(biāo)濃度為其質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)（0.3%）的8.0%（預(yù)實驗確定的LOD）~150.0%為參考，設(shè)置7個濃度點：0.5、1、2、4、6、8、9μg·mL-1。

 

5.4.2　操作步驟

 

精密量取“2.3”項下10μg·mL-1的對照品溶液0.5、1、2mL，20μg·mL-1的對照品溶液2、4mL，30μg·mL-1的對照品溶液2、3mL，分別置10mL量瓶中，分別加“2.2”項下的供試品儲備液1mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成加樣濃度約為0.5、1、2、4、6、8、9μg·mL-1的溶液，每個濃度獨立制備3份。按照“3.1”項下的色譜條件進樣。結(jié)果匯總于表4。

 

 

5.4.3　結(jié)果分析

 

5.4.3.1　精密度　

 

通過對每個濃度進行方差成分分析，可獲得該分析方法在不同濃度下的重復(fù)性，中間精密度及其精密度上限值。設(shè)α=0.05，精密度結(jié)果表見表5。

 

 

5.4.3.2　準(zhǔn)確度　

 

通過對每個濃度下真實值（100%）與回收率結(jié)果的差值獲得方法在該濃度下的偏倚值，以及獲得其置信區(qū)間。設(shè)α=0.05時的結(jié)果分析表見表6。

 

 

5.4.3.3　方法能力的綜合評價　

 

對于準(zhǔn)確度與精密度的聯(lián)合判定，引入新的統(tǒng)計評價參數(shù)，方法變異、方法能力指數(shù)（MCI）、方法誤判率、方法分級、預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間。假定雜質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在90.0%~110.0%時能滿足產(chǎn)品檢測的需求，則分析結(jié)果見表7。

圖3和圖4為在不同濃度下的預(yù)測區(qū)間或容忍區(qū)間與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系圖。從表7、圖3和圖4可以看出，此分析方法在2.0~9.0μg·mL-1時，方法的準(zhǔn)確度與精密度能滿足產(chǎn)品檢測需求。

 

 

5.5　方法適用范圍

 

在準(zhǔn)確度、精密度、LOQ和線性滿足前提下的方法適用濃度范圍為2.0~9.0μg·mL-1。

 

5.6　溶液的穩(wěn)定性試驗

 

一次進樣需運行45min，為保證在方法驗證期間，所配制溶液的穩(wěn)定性，考察了供試品溶液在60h內(nèi)的穩(wěn)定性。

 

精密量取“2.1”供試品儲備液1mL至10mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，在0、5、10、20、30、40、50、60h按照“3”項色譜條件進樣，獲得依那普利和依那普利拉的峰面積。從表中可以看出，隨著所配制溶液放置時間的延長，依那普利拉逐漸增多，依那普利減少。在40h內(nèi)，依那普利拉峰面積的RSD=0.72%，溶液維持穩(wěn)定。

 

 

6　討論和結(jié)論

 

6.1　馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質(zhì)定量測定的檢測方法

 

2015年版《中國藥典》中對馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質(zhì)進行的是限度檢查，該方法的系統(tǒng)適用性試驗在主成分和雜質(zhì)組分均為20.0μg·mL-1時滿足藥典要求。但在進行實際產(chǎn)品檢測時，由于試驗時按2.0mg·mL-1濃度進樣（高于系統(tǒng)適用性濃度100倍），導(dǎo)致馬來酸峰與依那普利拉峰出現(xiàn)一定程度重合（圖5），使含量計算存在被低估的風(fēng)險。

 

 

為使馬來酸峰與依那普利拉峰能完全分開，保證能夠準(zhǔn)確定量依那普利拉峰，作者以歐洲藥典中原料藥依那普利拉的雜質(zhì)進行限度測定方法的色譜條件為基礎(chǔ)進行優(yōu)化，綜合考慮峰形、馬來酸峰與依那普利峰的分離度以及分析時間等因素，最終確定的色譜條件。

 

該方法的缺點是無法檢測到馬來酸依那普利中的雜質(zhì)依那普利雙酮，但本實驗主要用于對雜質(zhì)類定量分析方法性能參數(shù)的評估探討，故不影響此目的的闡述。

 

6.2　LOD和LOQ的確定

 

目前ICHQ2（R1）指南和專著給出的確定LOD與LOQ的方法可以歸為4類：

 

1）可視化的評估；

 

2）基于空白分布；

 

3）基于線性；

 

4）基于分析方法的精密度。

 

國內(nèi)最常應(yīng)用的是基于空白分布中信噪比法來確定LOD與LOQ。本文所計算LOD的方法是基于USP<1210>提出的線性95%的預(yù)測區(qū)間來確定，此方法不僅考慮了Ⅰ類錯誤與Ⅱ類錯誤，同時將實驗測定的變異性（不確定度）考慮在內(nèi)。

 

因此更加的可靠和科學(xué)。按照<1210>的闡述，該方法所得LOD可作為最小LOQ使用，但為保證LOQ更加可靠，本實驗將LOQ用10替代計算公式中的（t1-α；n-2+t1-α；n-2）。

 

6.3　準(zhǔn)確度和精密度的獲取和描述

 

目前國內(nèi)有關(guān)方法驗證的文章中通常對方法準(zhǔn)確度的評價僅提供偏倚及其置信區(qū)間，無法從整體體現(xiàn)方法的變異。系統(tǒng)精密度和重復(fù)性的驗證，通過對某一對照品溶液連續(xù)進樣6針來確定儀器精密度，將同一供試品溶液平行制備6份來確定方法的重復(fù)性。該方法節(jié)省時間成本，但是不能夠正確表明方法在不同濃度下的變異性。

 

本文中有8個實驗條件，每個實驗條件下對每個濃度獨立制備3份溶液，通過方差成分分析可以同時確定中間精密度與重復(fù)性。同理對于重復(fù)性和儀器精密度也可以按照本文的方法確定。本文的試驗設(shè)計充分考慮了不同濃度下該方法的變異，從整體把握方法的適用性及其適用范圍。

 

為了更充分表達所獲準(zhǔn)確度和精密度，本文所采用的設(shè)計，還能有效地計算出準(zhǔn)確度置信區(qū)間和精密度置信上限，從而為技術(shù)人員和監(jiān)管者更好地把握所得參數(shù)的可靠性提供依據(jù)。

 

6.4　方法能力綜合評價參數(shù)及其比單獨使用準(zhǔn)確度

 

和精密度評價的優(yōu)勢目前ICH指南、《中國藥典》和歐洲官方實驗室都使用準(zhǔn)確度和精密度單獨的標(biāo)準(zhǔn)進行方法驗證的判定。這里的限度標(biāo)準(zhǔn)多通過經(jīng)驗確定出，主觀性較大，且沒有與所檢測產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)直接聯(lián)系。

 

本次新增方法變異、預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間、方法能力指數(shù)等綜合評價方法滿足其預(yù)期用途的參數(shù)（有關(guān)其詳細含義請參見參見USP<1210>和本專欄《定量理化分析類方法滿足預(yù)期用途的判斷標(biāo)準(zhǔn)探討》），是對準(zhǔn)確度和精密度進行合成后衍生出的新參數(shù)，這些參數(shù)是對方法整體評價更全面的把握。

 

此外，將各濃度下計算的容忍區(qū)間和預(yù)測區(qū)間按濃度-質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度進行構(gòu)圖（見表7和圖3和圖4），可更清晰和直觀地了解方法在不同濃度下的判斷，具有科學(xué)、直觀的優(yōu)勢。

 

本方法對依那普利拉雜質(zhì)的檢測，在LOQ0.8~2.0μg·mL-1的范圍，只可確保標(biāo)示量的±20%的變異內(nèi)檢測準(zhǔn)確，在2.0~9.0μg·mL-1濃度范圍，其容忍區(qū)間均包含于±10%以內(nèi)，且對產(chǎn)品質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)為6.0μg·mL-1濃度周圍，該方法的變異容忍區(qū)小于±5%，方法能力指數(shù)達到1.02，因方法變異產(chǎn)生的誤判率為0.2%；故認為是一個非?？煽康亩繖z測方法。

 

本次方法驗證所獲預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間不僅可用于新方法進行方法驗證，也為后續(xù)方法的轉(zhuǎn)移和驗證判定提供依據(jù)，即方法轉(zhuǎn)移或確認時，進行一次實驗所獲得的結(jié)果應(yīng)分布于預(yù)測區(qū)間內(nèi)，所有試驗結(jié)果的90%應(yīng)處于容忍區(qū)間內(nèi)。

 

6.5　結(jié)論

 

該方法滿足對馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質(zhì)進行定量檢測的要求。在專屬性方面，依那普利拉峰與馬來酸峰和依那普利峰間的分離度分別為19.0和30.9。在線性、LOD和范圍方面：在0.5~1.2μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，線性方程為Y=139.86+38982.17X，r=0.9998；殘差標(biāo)準(zhǔn)誤為2693.44，且殘差呈隨機分布，截距與零無顯著差異。

 

由此確定雜質(zhì)依那普利拉可通過外標(biāo)法確定其含量；基于線性95%的預(yù)測區(qū)間確定的LOQ為0.76μg·mL-1。在綜合能力評價方面：2.0~9.0μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，方法的預(yù)測區(qū)間與容忍區(qū)間均分布于限度標(biāo)準(zhǔn)的90.0%~110%內(nèi)，在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度6.0μg·mL-1周圍，方法可達到Ⅲ級方法，因方法產(chǎn)生的誤判率僅為0.2%。溶液穩(wěn)定性：在40h內(nèi)溶液維持穩(wěn)定。