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多肽藥物近年發(fā)展迅速，2021 年全球多肽治療市場規(guī)模為 393 億美元，根據(jù)Grand View Research, Inc.一項新的數(shù)據(jù)，2022到 2030 年，多肽藥物（包括診斷試劑）市場將以預(yù)計6.4% 的復(fù)合年增長率增長，預(yù)計2030年將達(dá)到 687 億美元的水準(zhǔn)。癌癥以及骨質(zhì)疏松癥等代謝紊亂的發(fā)病率不斷上升，以及肥胖和糖尿病將都將成為推動肽療法的因素。由于受影響的兒科患者數(shù)量不斷增加，以及上述疾病在低收入國家的普遍存在，因此對高效和低成本的多肽藥物的需求將會不斷增加。此外，不斷增長的老年人口預(yù)計也將進(jìn)一步推動多肽治療的需求。

排除成本方面的不利影響，多肽藥物更為廣闊的應(yīng)用前景主要受到分子穩(wěn)定性和遞送方式的阻礙。多肽分子內(nèi)在的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了通常通過腸胃外給藥，約 75% 通過注射途徑，例如皮下、靜脈和肌肉給藥。盡管注射劑市場強(qiáng)勁，但注射劑仍然對患者具有侵入性，阻礙患者依從性。此外，注射劑增加了制造和儲存的復(fù)雜性，最終影響醫(yī)療成本。而以口服為代表的胃腸道給藥方式，盡管有傳統(tǒng)的cyclosproine A以及去氨加壓素，以及新近的semaglutide為代表，但這個領(lǐng)域的應(yīng)用遠(yuǎn)未形成集團(tuán)規(guī)模。

一口服多肽藥消化道吸收模式

多肽口服制劑的低生物利用度，主要歸咎于它們在胃腸道中的酶促降解，以及很低的腸道通透性。此外，即使進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，由于它們的不穩(wěn)定性也將導(dǎo)致被快速消除（半衰期短）。這些因素都限制了多肽在臨床環(huán)境中作為治療劑的使用。

藥物從消化道上皮細(xì)胞頂端到基底面的穿越途徑有多種機(jī)制。在細(xì)胞旁通路中，藥物以被動方式通過細(xì)胞之間緊密連接（圖 1，a），分子的尺寸與剛性都在此過程中都產(chǎn)生關(guān)鍵影響。在跨細(xì)胞途徑中，藥物分子可以通過被動方式穿過上皮細(xì)胞，也可以按照主動模式或者囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的方式實現(xiàn)（圖 1，b-d）。[1]被動運(yùn)輸受到多肽藥物分子親脂性和剛性控制。[2]主動運(yùn)輸由各種類型的膜蛋白介導(dǎo) 的多肽內(nèi)化實現(xiàn)，[3]在這個過程中膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的周轉(zhuǎn)率對于多肽分子的內(nèi)化至關(guān)重要?？偟膩碚f，這幾個機(jī)制是通過協(xié)同作用實現(xiàn)多肽分子的透膜吸收的，其貢獻(xiàn)度在很大程度上取決于多肽分子本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。

圖 1. 腸道攝取化合物從上皮細(xì)胞頂膜到基底面，通過腸道刷狀緣膜的方式。兩個主要通路: 被動細(xì)胞旁: 在細(xì)胞之間并通過緊密連接 (a) 和通過跨細(xì)胞途徑?？缂?xì)胞途徑包括被動通過細(xì)胞膜擴(kuò)散 (b), 主動的載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)（c）和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)（d）等不同機(jī)制。（圖片來源：Bioorganic & Medicinal Chemistry）

二為什么多肽N-甲基化

針對多肽分子的肽酶蛋白酶的不穩(wěn)定性，以及較低的消化道膜通透率，藥物分子設(shè)計人員已經(jīng)開發(fā)了多種策略以應(yīng)對酶促降解以及膜通透性問題，其中多肽分子的化學(xué)改性提供了一種有效的策略。 這些從化學(xué)角度（而非制劑）提高口服多肽生物利用度的方法包括多肽前藥、化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)修飾。例如聚乙二醇改性、脂化、糖基化、環(huán)化、D-氨基酸取代、非蛋白質(zhì)氨基酸取代，N-甲基化。

2.1 環(huán)孢素A的啟示

N-甲基化多肽在天然多肽中并不罕見，在上世紀(jì)80年代就得到FDA批準(zhǔn)上市的第一款口服多肽藥物環(huán)孢素A（CsA, cyclosporine A，商標(biāo)名Neoral®）中就出現(xiàn)了出現(xiàn)了7個N-甲基化氨基酸（CsA分子11個氨基酸殘基）。其中Me-Leu9 和 Me-Leu10兩個相鄰殘基之間的酰胺鍵的構(gòu)象在其中發(fā)揮了微妙但關(guān)鍵的作用（圖2）。[4]這個結(jié)構(gòu)特殊的肽骨架酰胺鍵的cis/trans構(gòu)象平衡在很大程度上取決于多肽分子所處環(huán)境的極性。在極性溶劑中，或者與受體親環(huán)蛋白（cyclophilin）結(jié)合的情況下，trans構(gòu)象占主導(dǎo)地位。但在非極性溶劑，或者晶體形態(tài)下，采取主導(dǎo)的則換成了cis構(gòu)象。這個N-甲基化的酰胺鍵對于CsA最終被開發(fā)成口服制劑起到了非常關(guān)鍵的作用。[5]

圖2. CsA化學(xué)結(jié)構(gòu)（紅色酰胺鍵為N-Me-Leu9-N-Me-Leu10 主鏈肽鍵）

既然自然界給人們提供了口服多肽制劑的成功范例，研究者自然不能暴殄天物，對N-甲基化修飾多肽的潛在策略視而不見。通常來說，人們很難建立起特定的化學(xué)修飾（例如N-甲基化）與口服生物利用度之間的絕對聯(lián)系，即便強(qiáng)行建立，這樣的規(guī)律也很有可能是孤立的。作為一種二級氨基酸（secondary amino acid），N-甲基化的氨基酸對于母肽二級空間結(jié)構(gòu)變化所產(chǎn)生的影響也是十分巨大的，這同樣會帶來物理化學(xué)性質(zhì)以及生理活性等一系列的效應(yīng)。我們都知道，Pro在多肽結(jié)構(gòu)中扮演者非常重要的角色，多肽中的某個氨基酸殘基如果被Pro取代，整條多肽的二級結(jié)構(gòu)有可能會發(fā)生重大變化。這是因為像Pro和Sar這樣的二級氨基酸會顯著影響它們與其N側(cè)氨基酸形成的肽鍵的cis/trans平衡，使得這個平衡偏向于不常見的cis構(gòu)象。從化學(xué)熱力學(xué)角度來看，trans-構(gòu)象的肽鍵通常能量較低，因此較為穩(wěn)定，絕大多數(shù)的常規(guī)肽鍵因此主要采取trans構(gòu)象（這當(dāng)然是一個統(tǒng)計學(xué)意義上的概念，cis-trans之間是一個不斷相互轉(zhuǎn)化的平衡過程）。這一點可以很容易地通過多肽在液相中的NMR譜圖得以證實。當(dāng)然，二級氨基酸所形成的三級酰胺鍵（tertiary amide）因為不再連接H原子，從而喪失了作為H-鍵供體的角色，這也會對多肽的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。N-甲基化對于多肽空間結(jié)構(gòu)的影響，它對多肽藥物膜通透性的連帶關(guān)系是一個非常復(fù)雜的龐大課題，以目前的技術(shù)水平尚無法取得一個服眾的統(tǒng)一理論來建立此兩者之間的模型關(guān)系，盡管N-甲基化對于多肽膜通透性可能產(chǎn)生作用這一結(jié)論大家都是認(rèn)可的。CsA就是一個很好的例子，這種天然產(chǎn)物機(jī)制的復(fù)雜性是獨一無二的，已成為研究多肽口服制劑生物利用度的主要模型之一。然而，微妙的構(gòu)象轉(zhuǎn)化很難復(fù)制在其它的合成多肽類似物中，從這個角度上看，CsA仍然像個曲高和寡的孤例，盡管令人高山仰止，但仰之彌高，鉆之彌堅，瞻之在前，忽焉在后。目前人們很難復(fù)制它的高生物利用度機(jī)制。能夠明確的是，CsA分子中廣泛存在的N-甲基氨基酸，以及其所導(dǎo)致的H-鍵供體缺失，缺少能夠溶劑化的酰胺鍵H，親脂性的側(cè)鏈，以及結(jié)構(gòu)單元（一個βII'轉(zhuǎn)角和一個βVI轉(zhuǎn)角）都對CsA這個幾乎違犯了所有利平斯基規(guī)則的多肽分子可觀口服生物利用度（F=15-50%）做出了貢獻(xiàn)。除了N-甲基化影響多肽結(jié)構(gòu)并擾動膜通透率之外，其它的化學(xué)修飾也可能產(chǎn)生類似的效果，比如環(huán)化、D-氨基酸，以及Cα-甲基化等。

2.2 N-甲基化溶劑化氨基酸導(dǎo)致增強(qiáng)的被動擴(kuò)散

多肽分子中溶劑化的酰胺鍵一旦被甲基化，它們與溶劑之間的H-鍵聯(lián)系有可能因此而被切斷，從而實現(xiàn)多肽分子親脂性的增加，并促進(jìn)以被動擴(kuò)散的方式實現(xiàn)膜透過。當(dāng)然這種關(guān)系也并非絕對，也存在因為溶劑化的肽鍵在N-甲基化之后膜透過率降低的情況，這可能與多肽的結(jié)構(gòu)以及修飾部位有關(guān)。[6]這方面最好的例子來自于三 N-甲基化Veber-Hirschmann的開發(fā)。

Veber-Hirschmann 肽 c(PFwKTF)，是一種環(huán)化的生長抑素，是天然多肽荷爾蒙生長抑素的類似物，對 sst2 和 sst5 生長抑素受體有選擇性。為了實現(xiàn)其口服遞送，研究者合成了30種不同位置不同程度的N-甲基化VH肽類似物（五-甲基化類似物無法通過化學(xué)合成手段實現(xiàn)），其中只有8個類似物有生長抑素受體活性，[7]而其中又只有一種（圖3）表現(xiàn)出Caco-2細(xì)胞膜的通透性（相對于未甲基化的VH母肽增加了68%），這個三-N-甲基VH肽實現(xiàn)了F=10%的大鼠口服生物利用度，而VH母肽與其它N-甲基VH肽類似物則幾乎完全沒有口服生物利用度。分子結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)，具有口服生物利用度的三-N-甲基VH肽與VH母肽相同，而且所有溶劑化的酰胺鍵都被N-甲基化。然而三-N-甲基VH肽對各種肽酶的穩(wěn)定性卻遠(yuǎn)高于VH母肽。研究同時發(fā)現(xiàn)，三-N-甲基VH肽中的L-MePhe11一旦被其對映異構(gòu)體D-Me-Phe替換，不僅多肽的生物活性完全喪失，就連Caco-2細(xì)胞膜的通透性也顯著降低。這個殘基替換導(dǎo)致了D-MePhe11和Pro6之間的肽鍵采取cis為主的構(gòu)象，并產(chǎn)生βII'轉(zhuǎn)角，而不是原來的βVI轉(zhuǎn)角二級結(jié)構(gòu)。7 VH肽改性的例子強(qiáng)烈地透露出了這樣的信息，即N-甲基化并不能確?？诜锢枚鹊奶岣撸嚯牡目臻g結(jié)構(gòu)才是最終決定這項數(shù)據(jù)的關(guān)鍵，N-甲基化需要滿足優(yōu)勢的空間構(gòu)型，在這個基礎(chǔ)上才可能實現(xiàn)生物利用度的目標(biāo)。

圖3. Veber-Hirschmann肽（左）和三-N-甲基Veber-Hirschmann肽（右）化學(xué)結(jié)構(gòu)

三總結(jié)

在目前已經(jīng)在北美，日本和西歐上市的150多種多肽藥物中，含有N-甲基氨基酸的種類并不多，例如abarelix中含有N-MeTyr, Cyclosporine和Dactinomycin中含有Sar和N-MeVal。然而隨著人們開發(fā)口服多肽治療劑的熱情不斷高漲，以N-甲基化為代表的化學(xué)修飾可能在多肽藥物分子設(shè)計中將扮演越來越重要的角色，它們在增加多肽穩(wěn)定性以及膜通透性方面有著非常大的利用空間。與此同時，多肽化學(xué)與空間結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的不斷深入研究，也能促進(jìn)研究者通過化學(xué)修飾來改善并控制多肽二級結(jié)構(gòu)的目標(biāo)，系統(tǒng)性的N-甲基化scan也同樣能起到關(guān)鍵的作用。這個領(lǐng)域的進(jìn)步，或許能夠幫助研究者從傳統(tǒng)的試差法，逐漸轉(zhuǎn)向有的放矢的的N-甲基化“工程”，推動更合理的多肽藥物從頭設(shè)計，結(jié)合藥物遞送領(lǐng)域的協(xié)同進(jìn)步，催生口服多肽制劑浪潮的真正到來。